Transcript and metabolic profiling of two Vitis vinifera L. cultivars : a contribution for the study of resistance capabilities against pathogenic fungi

Abstract

Grapevine (Vitis) species are the most economically important fruit crop worldwide but they are prone to several diseases, being fungi pathogens the major problem of its cultivation around the world. Vitis vinifera response against pathogens is a complex process that differs within cultivars. The mechanisms that enable the plant to reduce the disease incidence are not fully understood. A better knowledge of the complexity of the resistant capability of cultivars, such as Regent, is determinant for an overall understanding of the resistance mechanism and for the definition of improvement strategies for highly susceptible crop species. Transcript and metabolic profiling of in-field growing Regent (resistant) and Trincadeira (sensitive) cultivars were achieved through cDNA microarray and 1HNMR. Plants were collected prior to flowering, this way transcript and metabolic differences between both cultivars revealed their behaviour for the same environmental conditions. The results from the present work suggest that Regent has an intrinsic resistance capability. Transcripts coding for a tonoplast intrinsic protein, J2P and several transcripts associated with defence were found up regulated in Regent, suggesting higher resistance to stress. The regulation of transcripts coding for phenylalanine ammonia lyase, cinnamyl alcohol dehydrogenase and WD-repeat protein-like also suggests a constitutive accumulation of phenolic compounds in Regent. The regulation of transcripts coding for TIP suggest increased resistance to drought stress. Regent cultivar presents higher abundances of myo-inositol, glutamine, glutamate, alanine, and caffeic acid derivative which could be associated with its inherent resistance to fungi presented. Myo-inositol and alanine could act as stress signalling molecules, enabling a faster response in the case of pathogen attack. High glutamine abundance could suggest increased activity of PAL and phenylpropanoid metabolism. Caffeic acid derivatives may be related to the resistance response after pathogen attack, since constitutive phenolic compounds are known to confer resistance, either directly or indirectly, through activation of post-infection responses.

A cultura da videira é uma actividade de importância económica mundial, com grande relevância em Portugal. Esta cultura é afectada por diversos patógenos, nomeadamente fungos. A videira apresenta mecanismos de defesa complexos que diferem entre cultivares. Estes mecanismos que conferem à planta capacidade de reduzir a incidência das infecções por patógenos são pouco conhecidos. Um maior conhecimento das capacidades de defesa apresentadas por algumas cultivares resistentes como a Regent, é determinante, para o melhoramento de cultivares sensíveis, sobretudo se forem comercialmente importantes. A aplicação de técnicas de biologia molecular e análise química, como os microarrays de cDNA e o 1H NMR à caracterização de transcritos e metabolitos em larga escala, permitiu o desenvolvimento de disciplinas científicas como a transcritómica e a metabolómica que fornecem grande quantidade de dados. Neste trabalho, foram aplicadas técnicas de caracterização do transcritoma e metaboloma o que permitiu a diferenciação entre duas castas de videira, Regent e Trincadeira, que têm sido descritas como variedades resistente e sensível, respectivamente, a patógenos. Foram analisadas folhas de ambas as castas de videira, colhidas no campo antes da formação de inflorescências. As diferenças encontradas na expressão de transcritos e na abundância de metabolitos refletem a resposta das duas castas às mesmas condições ambientais no campo. Para a comparação da expressão génica foi construída uma biblioteca de cDNA utilizando folhas de cada uma das castas Trincadeira e Regent. Para tal, foi desenvolvido um novo método para a síntese da biblioteca de cDNA, baseado na técnica de PCR. Este método inovador conjuga o melhor de duas das tecnologias líder na área, nomeadamente a recombinação e a troca de template pela transcriptase reversa. Este protocolo permitiu a eliminação dos passos de digestão e sub-clonagem, que são normalmente necessários, e a obtenção rápida de clones de cDNA para a aplicação em microarrays. Foram comparados os transcritomas foliares de ambas as castas, e os transcritos que apresentaram uma variação estatísticamente significativa foram analisados. Após sequenciação foram identificados transcritos relacionados com a fotossíntese, produção de energia, stress e defesa, regulação da transcrição e tradução, regulação da expressão génica nos cloroplastos, transporte celular e modulação proteica. Os metabolitos identificados a partir da análise do metaboloma, e cuja abundância permite a diferenciação das duas castas, são o mio-inositol, a glutamina, o glutamato, a alanina, derivados do ácido cafeico, a glucose, o ácido succínico e um composto fenólico de identidade desconhecida. Os resultados deste trabalho sugerem que a casta Regent é intrinsecamente mais resistente do que a casta Trincadeira. Esta característica poderá estar relacionada com a activação de genes relacionados com processos de defesa e que codificam para proteínas como a phenylalanine ammonia lyase, S-adenosyl methionine synthase, subtilisin -like protease, WD-repeat protein like, tonoplast intrinsic protein e J2P. A maior abundância de metabolitos como o mio-inositol, glutamina, glutamato, alanina e derivados do ácido cafeico, metabolitos que são normalmente produzidos após o ataque por fungos patogénicos, vem também confirmar a maior resistência verificada na casta Regent. A sobre-expressão de transcritos codificantes de uma subtilisin like protease pode ser relevante quando a casta Regent é infectada por um patógeno, visto que estas proteínas participam na regulação de processos biológicos como o reconhecimento de agentes patogénicos, com subsequente activação de respostas de defesa. A sobre-expressão de transcritos codificantes de uma S-adenosyl-L methionine synthase pode estar relacionada com uma maior produção na casta Regent de S-adenosyl methionine, sendo que esta molécula pode ser percursora ou participar na biossíntese de classes de fenilpropanóides e poliaminas, compostos que participam em mecanismos de defesa. Por outro lado, a sobreexpressão de transcritos que codificam uma phenylalanine ammonia lyase sugere uma maior acumulação de compostos fenólicos. A sobre-expressão de transcritos que codificam uma WD-repeat protein –like pode estar também associada a uma maior acumulação de compostos fenólicos nesta casta. Uma maior acumulação de derivados do ácido cafeico pode estar relacionada com a regulação da phenylalanine ammonia lyase e, provavelmente, com a regulação da S-adenosyl-L methionine synthase. A acumulação de derivados do acído cafeico na Regent sugere uma maior resistência desta casta uma vez que a ocorrência constitutiva de compostos fenólicos está relacionada com a formação de barreiras químicas ao estabelecimento e propagação da infecção e pode proteger a planta em caso de ataque de patógenos. A acumulação de compostos fenólicos é reconhecida por conferir uma maior resistência directamente ou indirectamente pela activação de respostas de defesa. Por outro lado, a acumulação de transcritos que codificam uma tonoplast intrinsic protein pode estar relacionada com uma maior capacidade de resposta em caso de stress hídrico, levando a uma maior resistência. O mio-inositol pode actuar como uma molécula de sinalização, permitindo uma rápida resposta de defesa em caso de ataque de um patógeno. Por um lado, a glutamina pode estar directamente relacionada com uma maior actividade da phenylalanine ammonia lyase, uma vez que ajuda a célula a reciclar os iões amónio da fenilalanina. Por outro lado, o glutamato é um precursor de duas moléculas de resposta a stress, nomeadamente a prolina e a glutationa. A alanina, cuja acumulação tem sido detectada em resposta a diversos stresses, pode funcionar como uma molécula sinalizadora induzindo uma rápida resposta de defesa. A casta Trincadeira é uma casta muito sensível a infecções por patógenos. Esta casta apresentou uma sobre-expressão de transcritos relacionados com a fotossíntese, de transcritos associados com o mecanismo antioxidante e de transcritos codificantes para a NADH dehydrogenase subunit A, sugerindo que, para as mesmas condições ambientais, esta cultivar apresenta um menor controlo da regulação fotossintética relativamente à cultivar Regent. Desta forma, necessita da acção do sistema anti-oxidante para controlar os radicais livres de oxigénio que se formam nas reacções fotossintéticas prevenindo assim os danos foto-oxidativos. Esta casta apresenta também uma maior acumulação de glucose e ácido succínico e uma sobre-expressão de transcritos codificantes para uma glyoxysomal NAD-malate dehydrogenase e para um putativo factor de transcrição relacionado com processos de desenvolvimento em plantas tais como o desenvolvimento dos frutos e a senescência. Este factor de transcrição apresenta elevada homologia com o gene VvMSA, que controla a expressão de um transportador de hexoses o qual possui elevada afinidade para a glucose. A elevada acumulação de glucose nesta casta sugere, por um lado, um elevado transporte de glucose para as folhas. Por outro lado a sobre-expressão de um transcrito codificante para uma glyoxysomal NAD-malate dehydrogenase e a elevada acumulação de ácido succínico e glucose sugerem uma maior conversão de lípidos em carbohidratos. Os resultados deste trabalho permitem formular a hipótese de que as plantas da casta Regent são intrinsecamente mais resistentes ao stress. A sua resistência a patógenos, nomeadamente fungos, poderá estar relacionada com a presença constitutiva de compostos fenólicos e com uma rápida indução da resposta de defesa quando em contacto com um patógeno.