Pabpn1 protein : aggregation properties in an opmd cellular model and a novel role in splicing

Abstract

Eukaryotic gene expression is a complex stepwise process that begins with transcription initiation and terminates with the synthesis of a specific protein. Before being transported out of the nucleus as mRNAs, primary gene transcripts undergo a series of co- and post-transcriptional maturation events. During transcription, the nascent transcript is capped in its 5´ end, introns are spliced and the 3´end is cleaved and polyadenylated. The mature mRNA is then released from the site of transcription and exported to the cytoplasm for translation. Although these transcriptional maturation processes tend to be studied in a rather simplistic isolated manner, ample evidence exists demonstrating that the various events that constitute pre-mRNA maturation occur in an integrated fashion. Distinct machines carry out each of the steps in the gene expression pathway but despite the unique reactions they catalyse, each machine also interfaces both physically and functionally with other machines in the pathway. More specifically, a wide number of studies have highlighted the role of the Carboxyl Terminal Domain of the largest subunit of RNA Polymerase II as the key determinant player in the coupling of the pre-mRNA maturation events. In this work we have addressed the question of the co-ordination of all the steps of pre-mRNA processing using the poly(A) binding protein nuclear 1 (PABPN1) as a tool. PABPN1 is an abundant nuclear protein that stimulates poly(A) polymerase (PAP) during polyadenylation of mRNA precursors in metazoan cells. PABPN1 acts primarily as a stimulatory factor for the extension of the poly(A) tail and remains associated to the mRNA after the poly(A) addition, travelling with the mRNA to the cytoplasm where translation occurs. In addition to the very well characterized role in stimulating PAP, there are some other reports of additional PABPN1 functions. For instance, PABPN1 has been found in the nuclear nonsense-mediated decay complex, which is thought to complete a "pioneer" round of translation checking the integrity of the mRNA. PABPN1 has also been shown to associate with RNA Polymerase II along the chromatin axis and has been proposed to participate in transcription by associating with the Ski-interacting pre-spliceosomes, thus likely to be recruited protein and with MyoD. It has also been identified as a component of the spliceosome, neither stably associated with U4/U6.U5 tri-snRNPs nor present in purified to the spliceosome at a later, more active, stage of its assembly. Our results demonstrate that PABPN1 plays an unforeseen role in the splicing reaction. Combining a series of in vitro pulldown and immunoprecipitation assays, PABPN1 is shown to interact directly with very well characterized splicing factors and to be recruited to intronic sequences upon gene transcription activation. PABPN1 is also shown to modulate splice site choices in splicing reporter mini-genes, therefore implicating PABPN1, directly or indirectly, in alternative splicing regulation. In addition to its novel role in splicing, we also tried to understand the role of PABPN1 in a human genetic disease called Oculopharyngeal Muscular Dystrophy (OPMD). In 1998, it was found that mutations on the PABPN1 gene were responsible for OPMD. The mutation consists of short (GCG) expansions that result in the expansion of a polyalanine stretch at the N-terminus of the protein. Following the initial methionine, the wild type PABPN1 protein contains a naturally occurring trinucleotide repeat (GCG)6 coding for the first 6 alanines in a 10 tandem alanine stretch. In the OPMD patients, the (GCG)6 repeat is expanded to (GCG)8-13, thus leading to an expansion of the polyalanine tract from 10 to 12-17 alanines in the N-terminus of PABPN1. Because intranuclear inclusions containing PABPN1 represent a pathological hallmark of muscle cells from OPMD patients, it has been suggested that the mutated PABPN1 induces or facilitates the formation of the inclusions. To investigate whether this was the case, we have generated green fluorescent protein (GFP) fusions with PABPN1 variants. These fusion proteins were transiently expressed in human HeLa cells and in the murine myogenic cell line C2. We showed that, upon over-expression, PABPN1 aggregation can occur in the absence of polyalanine expansion. We further demonstrated that propensity of PABPN1 to form intranuclear inclusions is coupled to stimulation of polyadenylation, and protein aggregation is a highly dynamic, reversible process. Our results contributed greatly for the interpretation of OPMD model systems based on exogenous expression of PABPN1.

A expressão do complemento proteómico do genoma ocorre através da síntese de uma molécula intermediária designada por RNA mensageiro (mRNA). A biogénese do mRNA ocorre no núcleo celular através da acção da RNA Polimerase II (RNA Pol II), que descodifica a linguagem contida nos genes e a converte num mRNA através de um processo designado por transcrição. Este mensageiro é inicialmente sintetizado sobre a forma de uma molécula precursora, o pré-mRNA, que é alvo de intenso processamento. Após o processamento do pré-mRNA, obtém-se um mRNA maduro que é exportado para o citoplasma. Uma vez no citoplasma, o mRNA é alvo de um processo designado de tradução, processo este através do qual a linguagem nucleotídica do mRNA é convertida numa linguagem aminoacídica, dando origem a uma proteína específica. Durante a transcrição, o pré-mRNA neo-sintetizado é concumitantemente processado. O processamento do transcrito envolve principalmente três eventos: adição de um cap protector na extremidade 5´ (capping), remoção de sequências intrónicas não codificantes e junção das sequências exónicas codificantes ladeantes (splicing), e adição de uma cauda de poli-adeninas (poli(A)) na extremidade 3´ (poliadenilação). Com apenas uma única excepção conhecida, todos os pre-mRNAs eucariotas são poliadenilados, adquirindo desta forma uma cauda poli(A) na sua extremidade 3´. O processo de poliadenilação envolve duas etapas, uma etapa de clivagem e uma etapa de poliadenilação propriamente dita. Primeiro, numa ligação fosfodiéster específica, o pre-mRNA é clivado endonucleotidicamente. Em seguida, uma cauda de poli(A) é adicionada ao produto 5´ recém criado enquanto o produto 3´ é eventualmente degradado por um mecanismo ainda pouco conhecido. O processamento 3´ do pré-mRNA, incluindo clivagem do transcrito e adição da cauda de poli(A), é uma reacção relativamente simples do ponto de vista bioquímico. Não obstante, a esta simplicidade contrapõe-se a necessidade de participação de mais de uma dezena de polipéptidos, quase todos eles necessários na etapa de clivagem. Após a reacção endonucleolitica de clivagem, apenas duas proteínas persistem associadas ao pre-mRNA, CPSF (cleavage and polyadenylation specificity factor) e PAP (polyA polymerase). Estas duas proteínas são capazes de iniciar a síntese da cauda de poliadeninas mas apenas de uma forma lenta e muito ineficiente. Por forma a obter uma cauda de poli(A) completa, uma proteína adicional tem de ser recrutada para o complexo CPSF-PAP, a proteína PABPN1 (polyA binding protein nuclear 1). A PABPN1 é uma proteína nuclear abundante, expressa em todos os tipos celulares, desempenhando um papel essencial na poliadenilação do mRNA ao estimular a extensão e controlando o comprimento das caudas de poli(A) neo-sintetizadas. Através do estabelecimento de interacções proteicas directas com as proteínas CPSF e PAP, a PABPN1 estabiliza o complexo trimérico associado ao RNA, conduzindo à síntese eficiente da cauda de poli(A). A entrada em cena da PABPN1 na segunda etapa do processamento a 3´ permite um aumento exponencial da eficiência 1 da reacção de poliadenilação, culminando na síntese de uma cauda de aproximadamente 250 adeninas adicionados num evento único. Em 1998, foi descoberto que uma mutação no gene que codifica a proteína PABPN1 humana estava na origem de uma doença, a Distrofia Muscular Oculofaríngea (OPMD, do inglês Oculopharyngeal Muscular Dystrophy). A mutação consiste numa expansão de trinucleótidos que codificam o aminoácido alanina. A proteína PABPN1 normal possui, na região N-terminal e logo após a metionina inicial, seis alaninas em tandem codificadas por uma sequência repetitiva de trinucleótidos GCG. Nos doentes OPMD detecta-se uma expansão anómala desta sequência repetitiva, a qual resulta num aumento do número de alaninas presente na proteína. A inserção de apenas três repetições GCG conduz ao desenvolvimento de doença, não estando descritas repetições, em número, superiores a sete. Do ponto de vista anatomo-patológico, a OPMD caracteriza-se pela presença de inclusões intranucleares no músculo esquelético afectado pela miopatia. Estas inclusões são formadas por filamentos de aspecto tubular, com um diâmetro interior de 3 nm, um diâmetro exterior de 8.5 nm e um comprimento máximo de 250 nm, que se dispõem em forma de paliçada. Em trabalhos previamente publicados, foi demonstrada a presença da proteína PABPN1 nas inclusões OPMD, bem como de RNA poliadenilado, ubiquitina e subunidades de proteassoma. O aparecimento de inclusões patológicas formadas por agregados de proteínas mutadas verifica-se em diversos tipos de doenças degenerativas, como as doenças de Alzheimer, Huntington e Parkinson, as amiloidoses e as encefalopatias espongiformes. O estudo dos mecanismos envolvidos no processo de formação destes agregados patológicos reveste-se de grande interesse médico, uma vez que tem o potencial de contribuir para a descoberta de fármacos capazes de evitar ou retardar a formação de novas inclusões, ou ainda de promover a dissolução de inclusões já formadas. Neste contexto, neste trabalho propusemo-nos analisar os mecanismos moleculares que conduzem à formação de agregados intranucleares de PABPN1 no músculo de doentes OPMD. Como modelo experimental, induzimos a expressão ectópica e transitória de várias formas mutadas do gene PABPN1 em células em cultura, quer em células epiteliais humanas quer em mioblastos de ratinho. Os nossos resultados mostraram, pela primeira vez, que a expressão de proteína PABPN1 a níveis superiores aos fisiológicos provoca a sua agregação dando origem a inclusões nucleares semelhantes às observadas no músculo de doentes OPMD. Tal como as inclusões OPMD, os agregados induzidos por sobre-expressão são insolúveis, formam filamentos tubulares com cerca de 8 nm de diâmetro, e acumulam RNA poliadenilado. Face a estas semelhanças, decidimos usar o modelo da transfecção transitória de linhas celulares para identificar quais os domínios estruturais da proteína PABPN1 envolvidos no processo de agregação. Dada a correlação entre o desenvolvimento da patologia OPMD e a expansão de alaninas na proteína PABPN1, o resultado mais surpreendente foi a demonstração que a sequência de alaninas é totalmente dispensável para a formação das inclusões nucleares. A capacidade de agregação da proteína PABPN1, dando origem a inclusões nucleares, não aparenta estar directamente relacionada com a sequência de alaninas que sofre uma expansão nos doentes com OPMD, mas antes com a capacidade da proteína se ligar a RNA e com a capacidade da proteína em estimular a PAP no 2 processo de poliadenilação. A sobre-expressão de PABPN1 selvagem ou mutantes PABPN1 sem quaisquer alaninas no seu domínio N-terminal revelaram-se suficientes para conduzir à formação de inclusões intra-nucleares. Por outro lado, a sobre-expressão de mutantes PABPN1 com substituições pontuais no domínio de ligação a RNA e/ou no domínio de estimulação da PAP não resultou em agregação. A causa da danificação celular nos doentes OPMD continua por descortinar. As evidências experimentais existentes apontam para o facto de não existir qualquer ligação entre a disfunção muscular e a reacção de poliadenilação. De facto, a proteína expandida é perfeitamente funcional em reacções de poliadenilação in vitro. Mais ainda, não se encontram diferenças na dimensão das caudas poli(A) de mioblastos em indivíduos normais e em doentes OPMD. Isto sugere que a expansão trinucleotídica não afecta a função da PABPN1 no processamento 3´ e que funções adicionais da PABPN1 podem estar na génese da doença. De facto, e em concordância com o postulado no parágrafo anterior, a proteína PABPN1 tem sido pontualmente aventada como participante activo noutros processos biológicos. Para além da sua bem estabelecida função na reacção nuclear de poliadenilação, a PABPN1 tem sido descrita como uma proteína necessária noutras etapas do processamento de RNA que não exclusivamente o processamento nuclear 3´ terminal do pré-mRNA. Por exemplo, a PABPN1 foi recentemente implicada em processos como transcrição de genes específicos de músculo, degradação de mRNA por NMD (Nonsense Mediated mRNA Decay) e poliadenilação citoplasmática em etapas primordiais do desenvolvimento de Drosophila melanogaster. Tal multiplicidade de funções não é de estranhar. O quadro emergente relativo ao processamento do pré-mRNA aponta para uma integração de mecanismos onde as maquinarias de transcrição e das demais etapas processivas estão intimamente conectadas. Embora cada etapa particular seja executada por maquinaria própria e específica, catalisadoras de reacções únicas, estes diferentes complexos proteicos parecem estar física e funcionalmente interligados, desde as etapas iniciais até às etapas terminais do processamento do pré-mRNA, muitas vezes até sendo capazes de influenciar o destino citoplasmático do mensageiro. Na génese de tamanha interconectividade estão as proteínas de ligação ao RNA, que são cada vez mais interpretadas como proteínas capazes de executar múltiplas funções. Na altura em que iniciámos este trabalho, dois trabalhos particulares captaram a nossa atenção relativamente a um possível envolvimento da proteína PABPN1 na reacção de splicing, nomeadamente a identificação por espectrometria de massa da PABPN1 como um componente do complexo 45S activo do spliceossoma e a interacção directa da PABPN1 com o factor de splicing SKIP. Neste contexto, propusemo-nos averiguar se a PABPN1 teria algum papel na reacção de splicing. Para tal, começámos por produzir proteína recombinante PABPN1 humana num sistema eucariota e usando esta proteína como isco, perguntámos se a PABPN1 interagia com e com quais factores de splicing. Corroborando observações experimentais anteriores, começámos por observar 3 que a PABPN1 interagia com o factor de splicing SKIP de forma directa. Inicialmente através de tecnologia de espectrometria de massa e posteriormente por técnicas de imunoprecipitação e Western blotting, mostrámos que a PABPN1 interage com outros factores de splicing, nomeadamente os factores U2AF65, RNA Helicase p68, SF2-p32 e YB1. Estas observações sugeriam que, de facto, a PABPN1 poderia estar envolvida noutras etapas de processamento de pré-mRNA e não exclusivamente dedicada à reacção de poliadenilação. Tal hipótese saiu reforçada aquando da realização de experiências de imunoprecipitação de cromatina (ChIP, do inglês chromatin immunoprecipitation) utilizando anticorpos específicos para a PABPN1. Trabalhando com uma linha celular de ratinho estavelmente transfectada com várias cópias do gene humano da β-globina, gene este constituído por 3 exões e 2 intrões, verificámos um surpreendente recrutamento da proteína PABPN1 para ambas as regiões intrónicas após activação da transcrição do gene da β-globina. As observações conjuntas de interacção com vários factores de splicing e localização em regiões intrónicas após indução de transcrição conduziram-nos ao desenvolvimento de ensaios capazes de demonstrar o efeito da proteína PABPN1 ao nível dos mecanismos de splicing do pré-mRNA in vivo. Neste contexto, decidimos utilizar a técnica de interferência de RNA (RNAi, do inglês RNA interference) em células humanas, a qual permite silenciar de forma específica a expressão de um determinado gene. Utilizando oligos dsRNA específicos para a proteína PABPN1, perguntámos se uma diminuição da quantidade desta proteína poderia provocar alterações ao nível de splicing. Inicialmente, e apesar de termos conseguido reduzir os níveis endógenos da PABPN1 em cerca de 90% em células HeLa, não detectámos quaisquer alterações em termos de eficiência de splicing nos vários genes endógenos analisados. No entanto, quando à técnica de RNAi juntámos uma análise de expressão de mini-genes repórteres contendo locais de splicing 3´ alternativos, observámos que a redução dos níveis proteicos da PABPN1 conduzia a alterações dos padrões de splicing preferencialmente utilizados em condições controlo. O splicing dos pré-mRNAs é um processo altamente complexo e regulável, no qual a palavra precisão adquire extrema importância. Erros na montagem da maquinaria de splicing em locais incorrectos e a consequente obtenção de padrões aberrantes de splicing podem estar na génese de proteínas truncadas, desprovidas de função ou mesmo nocivas para um determinado organismo, ou até originar a não expressão de um determinado gene. A precisão com que o processo de splicing decorre é alcançada através da inspecção individual dos locais de splicing, por múltiplas vezes e por múltiplas proteínas. Neste trabalho, propomos que a proteína PABPN1 possa funcionar como uma destas proteínas. Muito provavelmente, a PABPN1 não é um factor de splicing essencial pois a redução dos níveis de PABPN1 não impede a ocorrência de splicing nem conduz a eventos de retenção de intrão. No entanto, a sua presença pode determinar onde e quando o spliceossoma se monta, levantando a possibilidade do envolvimento da PABPN1 na regulação de eventos de splicing alternativo.