Development of injectable hydrogels for application in tissue engineering

Abstract

Tissue engineering (TE) is an ever-growing and promising field in regenerative medicine, looking to develop biomimetic systems capable of replacing damaged tissues or organs. For that, biomimetic systems, such as hydrogels, based on natural macromolecules (e.g., chitosan), have been used. Currently, the most versatile hydrogel processing method is 3D bioprinting, a sophisticated method that allows the printing of different structures with excellent precision. However, the used system must gather injectability and printability features. Methacrylated chitosan (CHTMA)-based hydrogels have already been reported as injectable and cytocompatible systems. Still, these systems consisted of single crosslinked (covalent bonds) network, affording hydrogels with poor mechanical properties. As a way of improving upon this system, a new biomimetic, injectable, and cytocompatible dual-crosslinked (DC) CHTMA-Tricine-based hydrogel system, fully processed under physiological pH, was developed in this work. To do so, chitosan (CHT) was sequentially modified (in two reaction steps) with methacrylic acid (MA), and then, with tricine moieties affording CHTMA-Tricine in 74% overall yield. The methacrylate and tricine moieties’ insertion onto the CHT’s backbone was confirmed and quantified by spectroscopy technics, achieving 17% substitution degree (SD) for MA and 4% SD for tricine. DC CHTMA-Tricine-based hydrogels at 3%, 4% and 5% (w/v) concentrations were prepared in PBS, fully characterized (structurally and morphologically) and compared to their CHTMA-based counterparts. The injectability and printability capabilities of this new system were also evaluated. The system’s shear thinning properties were assessed and confirmed through rheological assays, so the system was considered injectable for all tested conditions. The 4% (w/v) concentration dispersion showed the best results and the system’s printability was also assessed and confirmed for this concentration. It was observed that the presence of non-covalent hydrogen bonds, established between tricine moieties, significantly improved the system’s mechanical properties when compared to its CHTMA counterpart, achieving, for instance, an increase of ~ 25 kPa (2.3 times higher) for the Young’s modulus and an increase of ~ 225.2 kJ.m־ᶟ (1.3 times higher) for the toughness, for 5% (w/v) concentration. 2D and 3D cytocompatibility was also conducted for the optimized CHTMA-Tricine-based system using MC3T3-E1 cells. 2D cytocompatibility tests showed no cytotoxicity for MC3T3 cells for all tested concentrations. Additionally, 3D cytocompatibility tests, at 4% (w/v) concentration, showed that MC3T3-E1 cells remain viable after 6 days encapsulated in the CHTMA-Tricine-based hydrogel system. However, these cells did not spread and a decrease in the metabolic activity and DNA content were observed. Overall, the results showed that the addition of tricine to the CHTMA-based system was an excellent option to improve upon its mechanical properties. Considering the lack of cell spreading, further studies should be carried out to overcome this limitation. Regardless, this novel injectable and printable DC CHTMA-Tricine-based hydrogel system has shown that it may be a promising option for future applications in tissue engineering and regenerative medicine.

A engenharia de tecidos é um ramo da medicina regenerativa em crescimento, que visa desenvolver sistemas biomiméticos capazes de substituir tecidos ou órgãos danificados. Para o efeito, sistemas biomiméticos como hidrogéis à base de macromoléculas naturais (e.g., quitosano) têm vindo a ser utilizados. Atualmente, o método mais versátil para o processamento de hidrogéis é a bioimpressão 3D, um método sofisticado que permite a impressão de diversas estruturas com excelente precisão. No entanto, é necessário que o sistema seja injetável e capaz de ser impresso. Hidrogéis à base de quitosano metacrilado, já foram descritos na literatura como sistemas injetáveis e biocompatíveis. No entanto, estes sistemas consistem numa rede polimérica interligada por apenas um único tipo de reticulação (ligações covalente), originando hidrogéis com fracas propriedades mecânicas. De modo a melhorar estes sistemas, foi desenvolvido neste trabalho um novo sistema biomimético, injetável e citocompatível, à base quitosano-metacrilado-tricina duplamente reticulado, e completamente processado a pH fisiológico. Para tal, o quitosano foi sequencialmente modificado (em duas etapas reacionais) com ácido metacrílico, e, em seguida, com tricina, num rendimento global de 74%. A inserção dos grupos metacrilato e tricina na cadeira de quitosano foi confirmada e quantificada através de técnicas espectroscópicas, obtendo-se 17% de grau de substituição de metacrilato e 4% de grau de substituição de tricina. Os hidrogéis de reticulação dupla à base de quitosano-metacrilado-tricina, nas concentrações de 3% (m/v), 4% (m/v), e 5% (m/v), foram preparados em PBS, totalmente caracterizados (estruturalmente e morfologicamente) e comparados com os seus homólogos à base de quitosano-metacrilado. As capacidades de injetabilidade e printabilidade do novo sistema foram também avaliadas. As propriedades de pseudoplasticidade do sistema foram determinadas e confirmadas através de ensaios reológicos e, como tal, o sistema foi considerado injetável para todas as condições testadas. A dispersão na concentração de 4% (m/v) mostrou os melhores resultados e a printabilidade do sistema foi verificada e confirmada para esta concentração. Observou-se que a presença das ligações não-covalentes por pontes de hidrogénio, estabelecidas entre resíduos de tricina, melhorou significativamente as propriedades mecânicas do sistema quando comparado com o seu homólogo à base de quitosano-metacrilado, atingindo-se, por exemplo, um aumento de ~ 25 kPa (2.3 vezes mais alto) no módulo de Young e de ~ 225.2 kJ.m־ᶟ (1.3 vezes mais alto) para a rigidez, para a concentração de 5% (w/v). O sistema de quitosano-metacrilado-tricina otimizado foi submetido a testes 2D e 3D de compatibilidade, usando células MC3T3-E1. Os testes de citocompatibilidade 2D não demonstraram citotoxicidade para as células MC3T3 para todas as concentrações testadas. Adicionalmente, os testes de citocompatibilidade 3D, na concentração de 4% (m/v), mostraram que as células MC3T3-E1 permaneceram viáveis após 6 dias encapsuladas no sistema desenvolvido. Contudo, estas células não proliferaram, e foi observado um decréscimo na atividade metabólica e na concentração de DNA. De um modo geral, os resultados demostraram que a adição da tricina ao sistema de quitosano-metacrilado foi uma excelente opção para melhorar as suas propriedades mecânicas. No que dia respeito à ausência de proliferação celular, será necessário realizar mais estudos de modo a ultrapassar esta limitação. Não obstante, este novo sistema desenvolvido, duplamente reticulado, injetável e imprimível, mostrou ser uma opção promissora para futuras aplicações na área da engenharia de tecidos e medicina regenerativa.