Molekularbiologische Untersuchungen zur Funktion der Squalen-Hopen-Cyclase aus Alicyclobacillus acidocaldarius

Abstract

Die Squalen-Hopen-Cyclase (SHC) von Alicyclobacillus acidocaldarius katalysiert die Cyclisierung des linearen Triterpens Squalen zum pentacyclischen Hopen. Diese Polycyclisierungsreaktion ist eine der komplexesten, von einem einzigen Enzym katalysierten biochemischen Reaktionen. Die Aufklärung der Röntgenstruktur dieser Triterpen-Cyclase ermöglichte es, die Funktion von Aminosäuren des aktiven Zentrums durch ortspezifische Mutagenese näher zu analysieren. Erstmals konnten SHC-Mutanten mit einem verändertem Produktspektrum isoliert werden. Neben einer verstärkten Bildung des tetracyclischen 17-Isodammara-20(21),24-diens (Phe601Ala) konnten bei der Tyr420Ala-Mutante mit den bicyclischen Verbindungen alpha- und gamma-Polypodatetraen sowie dem tricyclischen Malabaricatrien neue Cyclisierungsprodukte identifiziert werden. Diese Produkte belegen die Stabilisierungsfunktion der betreffenden Aminosäuren für die intermediären Carbokationen bei der Bildung des B-, C- und D-Rings während der Cyclisierungsreaktion. Die 6/6/5-Ringstruktur des Malabaricatriens und die 6/6/6/5-Ringstruktur des 17-Isodammara-20(21),24-diens deuten außerdem darauf hin, daß die Cyclisierung des C- und D-Rings zuerst zu fünfgliedrigen Intermediaten führt, die dann in einem zweiten Reaktionsschritt zu sechsgliedrigen Ringen erweitert werden. Damit ermöglichen diese Ergebnisse eine Modifikation der bisherigen Vorstellungen über den Ablauf der Cyclisierungsreaktion der SHC.

The squalene-hopene cyclase (SHC) from Alicyclobacillus acidocaldarius catalyzes the cyclization of the linear triterpene squalene to pentacyclic hopene. This polycyclization is one of the most complicated biochemical reactions catalyzed by one enzyme. The elucidation of the X-ray structure of this triterpene cyclase enables the analysis of active site amino acids by site-directed mutagenesis. For the first time SHC-mutants with altered product patterns could be isolated. Mutation Phe601Ala led to enhanced formation of tetracyclic 17-isodammara-20(21),24-diene. Bicyclic alpha- and gamma-polypodatetraene and tricyclic malabaricatriene were isolated as new products from mutant Tyr420Ala. These products indicate the role of these amino acids for the stabilization of intermediate carbocations during the formation of the B-, C- and D-rings in the polycyclization reaction. Additional the 6/6/5-ring structure of malabaricatriene and 6/6/6/5-structure of 17-isodammara-20(21),24-diene indicate that C- and D-rings are formed first as 5-membered rings which then undergoes ring expansion to 6-membered rings. Therefore the results led to a modification of previous conceptions of the cyclization reaction of the SHC.