Étude de la relation entre la transcription et la structure de riborégulateurs répondant à la thiamine pyrophosphate chez Escherichia coli
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Publication date
2023Author(s)
Nadon, Jean-François
Subject
Pauses transcriptionnellesAbstract
Dans cet ouvrage, l’étude de la relation entre la transcription et la structure de riborégulateurs répondant à la thiamine pyrophosphate chez Escherichia coli est décrite. Par des expériences de cinétique de transcription employant le facteur de transcription NusA et couplées à des expériences de mutagenèse dirigée, une structure de type tige-boucle induisant une augmentation de la demi-vie apparente de deux pauses transcriptionnelles dans le riborégulateur thiC a été découverte.
Par la suite, la présence de structures similaires situées près du codon d’initiation des riborégulateurs tbpA, thiM, lysC et btuB a été investiguée par des méthodes similaires. Les résultats suggèrent la présence de tige-boucles induisant une augmentation des pauses près du codon d’initiation de ces riborégulateurs, mais des expériences supplémentaires seront nécessaires pour la confirmer.
Afin de nous aider dans l’étude des systèmes comportant plusieurs pauses consécutives, l’utilisation du 6-nitropiperonyloxyméthyl (NPOM), une modification chimique de l’ADN agissant comme barrage transcriptionnel amovible, a été développée. Le NPOM a ensuite été utilisé pour étudier les deux pauses du riborégulateur thiC qui sont influencées par la tige-boucle en amont de la première et déterminer que l’effet apparent sur la seconde pause est seulement dû à la première pause, qui désynchronise les complexes transcriptionnels.
Finalement, le développement de méthodes de production de complexes transcriptionnels marqués avec des fluorophores, dans un but d’étude à l’appareillage d’observation de molécule uniques, est discuté. Premièrement, de l’ADN marqué avec deux fluorophores et faisant partie d’un complexe transcriptionnel lié à une lame de miscroscope via l’ARN a été utilisé pour faire une preuve de concept utilisant la perte de signal de ces fluorophores pour mesurer le temps requis pour transcrire un riborégulateur.. Deuxièmement, la production de
complexes transcriptionnels dont l’ARN est doublement marqué à des endroits spécifiques avec des fluorophores est discutée. Les méthodes employées, incluant une combinaison de transcriptions par étapes, d’incorporations de nucléotides non naturels dans l’ARN, de réactions chimiques spécifiques entre un groupement azoture et un DBCO ou un alcyne, ont donné des résultats variables, mais qui ont permis d’infirmer plusieurs hypothèses, en plus de produire un complexe transcriptionnel dont l’ARN est doublement marqué pour la première fois au laboratoire. Cela étant dit, l’utilisation du NPOM pour transcrire sur de longues distances a permis de marquer spécifiquement l’ARN à des positions jusqu’ici inaccessibles, ouvrant la voie à l’étude de l’ARN natif impliquant des marquages éloignés du site de départ de la transcription.
Collection
- Moissonnage BAC [4706]
- Sciences – Thèses [806]