L'étude des voies de sécrétion des cellules AtT20 l'association amylase d'orge et calreticuline dans le trafic distal de la glycoprotéine
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Publication date
2008Author(s)
Senta, Helena
Abstract
Dans le but d'étudier les voies de la sécrétion on a exprimé l'amylase d'orge dans les cellules neuroendocrines AtT20. Nos recherches démontrent que le site consensus de glycosylation présent dans la structure primaire de l'amylase d'orge est fonctionnel et qu'il est facilement reconnu par la machinerie de glycosylation. Ceci est la première fois que la glycosylation de l'amylase d'orge est produite. Cette glycosylation est du type riche en mannose et l'enzyme glycosylée maintient son activité catalytique envers son substrat l'amidon. Efficacement exprimée, la glycoprotéine est sécrétée dans le milieu extracellulaire. Cependant, cette sécrétion ne répond pas à la stimulation par sécrétagogue ce qui prouve qu'elle est exclue de la voie de sécrétion régulée (grains de sécrétion matures). Curieusement, on observe une nette différence dans la proportion de la glycoforme de la protéine sécrétée et celle retenue dans la cellule. Par des études dynamiques (marquage radioactif) on a pu établir que la proportion de la glycoforme retrouvée dans la sécrétion ne dépasse pas 50 % de la protéine totale tandis qu'on retrouve une moyenne de 70 % de la glycoforme dans la cellule. On a aussi observé ce comportement de l'amylase dans les cellules pancréatiques AR42J et les cellules PC12 de la glande surrénale. Par pontage chimique on a confirmé l'association d'amylase d'orge avec une autre protéine et identifié cette dernière comme étant la calréticuline. Selon nos résultats, dans les cellules AtT20, la calréticuline normalement résidente du réticulum plasmique, se lie spécifiquement à l'amylase glycosylée et l'accompagne du réticulum endoplasmique jusqu'à un compartiment acide localisé dans une région distale du post trans -Golgi. De plus, en neutralisant le pH intracellulaire, on a démontré un changement de la distribution et de la proportion d'amylase glycosylée dans la cellule, indiquant que la dissociation du complexe calréticuline-amylase pourrait se faire suite à un changement de pH dans ce compartiment. Enfin, nos recherches mettent en évidence un changement draconien de la distribution de la calréticuline cellulaire suite à la transfection de l'amylase. Les résultats apportés démontrent que le trafic de l'amylase d'orge dans les cellules neuroendocrines pourrait se faire via la calréticuline par un mécanisme actif et hautement spécifique. Dans un deuxième volet, notre étude avait pour but d'étudier le rôle du domaine C des alpha-amylases. Ce domaine structural présent dans toutes les amylases et faiblement associé au baril catalytique n'a pas un rôle défini. Nous avons construit des mutants du domaine C manquant un ou plusieurs feuillets [beta]. Transfectées dans les cellules, ces protéines mutantes ne sont pas détectées ni dans le milieu de sécrétion ni dans la cellule. De plus, nous n'étions pas en mesure de détecter leur activité catalytique. Par contre, dans le système d'expression in vitro les mutant sont efficacement traduits et transloqués dans les microsomes. Malgré ceci, les protéines demeurent catalytiquement inactives comme observé in vivo . Selon nos résultats, le seul mutant détectable dans les cellules conserve trois des quatre feuillets [beta] faisant face au domaine A. Nos résultats démontrent qu'un domaine C entier d'une amylase de source différente pourrait remédier à l'expression de la protéine dans les cellules sans toutefois reconstituer l'activité enzymatique. Ceci nous indique qu'un domaine C intact est nécessaire pour le bon repliement de la protéine et aussi pour une activité enzymatique valide.
Collection
- Sciences – Thèses [840]