Identificação de proteínas relevantes para fase G1 do ciclo celular de Saccharomyces cerevisiae diferencialmente presentes durante desativação de eIF5A
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Data
2020-04-17
Autores
Orientador
Zanelli, Cleslei Fernando
Coorientador
Pós-graduação
Biociências e Biotecnologia Aplicadas à Farmácia - FCFAR
Curso de graduação
Título da Revista
ISSN da Revista
Título de Volume
Editor
Universidade Estadual Paulista (Unesp)
Tipo
Dissertação de mestrado
Direito de acesso
Acesso aberto
Resumo
Resumo (português)
eIF5A é um fator de elongação da tradução conservado em arqueias e eucariotos, que interage com a subunidade maior do ribossomo 80S. É a única proteína que possui o aminoácido hipusina, formado pós-traducionalmente, essencial para sua função. eIF5A auxilia na tradução de proteínas que contêm motifs ricos em prolina, pois sequência repetida deste aminoácido pode causar parada do ribossomo em tradução devido à rigidez estrutural que forma. Na ausência de eIF5A funcional ocorre parada do ciclo celular em G1, na transição de G1 para S, tanto em Saccharomyces cerevisiae quanto em mamíferos, sugerindo papel essencial desta na tradução de proteínas importantes para a progressão do ciclo celular. Neste trabalho foi proposta a identificação das proteínas relevantes para a fase G1 que se encontram diferencialmente presentes durante desativação de eIF5A em S. cerevisiae. Foram utilizados dados de larga escala de perfil proteômico diferencial entre linhagens selvagens e mutantes de eIF5A, previamente obtido por nosso grupo, como ponto de partida para identificação das proteínas relevantes. A confirmação de níveis diferenciais destas proteínas foi realizada utilizando metodologia de Western blot após indução da desativação de eIF5A, utilizando o mutante sensível a temperatura hyp2-3. A desativação foi feita através do cultivo da linhagem mutante em temperatura semi-permissiva, que induz perda da função de eIF5A, porém mantendo viabilidade celular. Foi observado que a proteína Cka2 está diminuída durante a desativação de eIF5A, ela faz parte do complexo quinase CK2 que atua fosforilando proteínas envolvidas em diversos processos celulares, bem como o próprio ciclo celular. Também foi observado que Sic1, uma inibidora de ciclinas dependentes de quinase (CDK), que regula tipicamente a transição G1/S e através de vias que respondem a estresses, está diminuída durante desativação de eIF5A. Para também compreensão do impacto da inibição de eIF5A em mamífero, a linhagem de células de camundongo RAW 264.7 foi tratada com o inibidor da hipusinação GC7. Foi realizado ensaio de qRT-PCR em tempo real onde observou- se diminuição da expressão dos genes CCND1 (Ciclina D1), CDK4, CDK6 e E2F1, que estão diretamente relacionadas com a progressão da fase G1 do ciclo celular nos mamíferos, além de aumento da expressão dos genes CCND2 (Ciclina D2) e CDKN1A (p21), sendo p21 uma inibidora de CDK que atua inibindo a progressão de G1 para S. Em conclusão, a diminuição de Sic1 poderia indicar que as vias que a regulam se encontram normais, assim, a diminuição de Cka2, e por consequência da atividade do complexo CK2, poderia estar causando a parada em G1 na levedura, enquanto nos mamíferos este fenótipo pode ocorrer devido a diminuição da expressão de genes responsáveis pela progressão de G1 e pelo aumento da expressão da inibidora p21.
Resumo (inglês)
eIF5A is a translation elongation factor conserved in archaea and eukaryotes, that interacts with the major subunit of the 80S ribosome. It is the only protein to contain the amino acid hypusine, formed post-translationally, essential to its function. eIF5A helps the translation of proteins that contain proline enriched motifs, as repeated sequence of this amino acid can cause ribosome stall during translation due to the rigid structure that it forms. In the absence of functional eIF5A occurs cell cycle arrest in G1, on the transition of G1 to S, both in Saccharomyces cerevisiae and mammals, suggesting an essential role of it on the translation of important proteins to the progression of the cell cycle. In this work, it was proposed the identification of relevant proteins to the G1 phase that are present differentially during deactivation of eIF5A in S. cerevisiae. It was used data of high-throughput differential proteomic profile between wild type strains and eIF5A mutant strains, previously obtained by our group, as a starting point to the identification of the relevant proteins. The confirmation of the differential levels of these proteins was made using Western blot methodology after induction of eIF5A deactivation, using the temperature-sensitive mutant hyp2-3. The deactivation was performed through cultivation of the mutant strain in semipermissive temperature, that induces loss of function of eIF5A but maintain cell viability. It was observed that the protein Cka2 is decreased during eIF5A deactivation, this protein is part of the kinase complex CK2 that acts phosphorylating proteins involved in multiples cellular processes, as well as the cell cycle. It was also observed that Sic1, an inhibitor of cyclin-dependent kinase (CDK), which typically regulates the G1/S transition and by pathways that respond to stresses, is decreased during eIF5A deactivation. Also, to the comprehension of the impact of eIF5A inhibition in mammals, the mouse cell strain RAW 264.7 was treated with the hypusination inhibitor GC7. It was performed real-time qRT-PCR assay where it was observed decrease in the expression of the genes CCND1 (Cyclin D1), CDK4, CDK6 and E2F1, that are directly related to the progression of the G1 phase of mammal cell cycle, also increase in the expression of the genes CCND2 (Cyclin D2) and CDKN1A (p21), being p21 a CDK inhibitor that acts inhibiting the progression of G1 to S. In conclusion, the decrease of Sic1 could indicate that the pathways that regulate it are found normal, thus, the decrease of Cka2, and consequently the decrease of the activity of the CK2 complex, could be causing the G1 arrest in yeast, whereas in mammals the phenotype can occur because of decrease of the expression of genes responsible for the progression of G1 and the increase in the expression of the inhibitor p21.
Descrição
Idioma
Português