A system for detection and identification of foodborne pathogenic bacteria based on a “Combinatory qPCR” technology

Foodborne outbreaks are important issues worldwide. Two of the most important foodborne pathogens are Salmonella spp. and Listeria monocytogenes. The reference methods to detect foodborne bacteria are international standard operating procedures, ISO methods, which are recognized in the whole world. These methods are mostly culture-based methods that are time consuming (several days) and labor intensive. In order to identify faster the source of foodborne outbreaks, to better manage food-related crises and to allow a rapid batch release during own checks by the food business operators, tools for rapid and reliable detection and identification of pathogens in foodstuffs have been developed. The most promising alternative approaches are based on PCR or Real-Time PCR (qPCR) methods. However, several major drawbacks remain: i) the already developed qPCR detection systems mostly target only one foodborne pathogen (single-genus) and are therefore unable to simultaneously detect several foodborne pathogens; ii) these PCR or qPCR foodborne detection assays use a single primer-pair (single-target) and this can potentially lead to false negative results in case of mutation or deletion of the target sequence; iii) these assays are not harmonized and use distinct chemistries (e.g. TaqMan® or SYBR®Green) and different PCR programs and therefore cannot be used altogether as multi-genera detection system and iv) no official guideline with specific acceptance criteria are available to validate food microbiology qPCR assays. The CoSYPS Path Food project intends to overcome these drawbacks by developing and validating a multi-genera, multi-levels and multi-targets screening system for simultaneous detection of living Salmonella spp. and Listeria spp. in food samples. The name of the developed system is CoSYPS Path Food detection system for Combinatory SYBR®Green qPCR Screening system for pathogens detection in food samples. This detection system is composed of 11 SYBR®Green qPCR assays for the detection of Salmonella and Listeria genera and their discrimination at species and sub-species levels. Each level of discrimination (genus, species and subspecies) is composed of at least two assays in order to increase the probability to detect atypical strains which may be deleted or mutated for one of the targets. Thus, this multi-target system reduces the probability of false negative results compared to the current mono-target (q)PCR detection systems. All qPCR assays developed for the CoSYPS Path Food detection system were designed to be run simultaneously on the same plate and were all validated based on two available guidelines: one for food-microbiology PCR assays validation (ISO 22118: 2011) and the other for the validation of qPCR assays for GMO detection where qPCR is the gold standard (ENGL guidelines). In order to further facilitate the CoSYPS Path Food detection system analysis, a support tool has been developed. This tool provides all the information about the 11 SYBR®Green qPCR assays (e.g. primer sequences and primer concentration) as well as an automatic calculation of each PCR mix and a decision support system (DSS) to obtain a harmonized analysis of the qPCR results. This automated interpretation of the qPCR results guarantees the same conclusion regardless of the analyst. To apply the developed CoSYPS Path Food detection system to food matrices containing both dead and viable bacteria, a discrimination study on the dead versus viable bacteria using viability-qPCR was performed. This study demonstrated the limits of the viability-qPCR and concluded that an enrichment step before the qPCR analysis remains preferable to a viability-qPCR. From these results, the complete CoSYPS Path Food workflow was developed. It contains all steps, from food sample enrichment to strain isolation and confirmation, and was then validated on beef carcass swab samples. This type of sample was chosen as a food matrix model since meat is one of the most important vehicles of foodborne bacteria and “swabbing”, which is a surface sampling, was retained as generally recognized as the most appropriate technique in performing microbiological control of carcasses at the slaughterhouse. The complete CoSYPS Path Food workflow was thus validated on beef carcass swab samples spiked with one or both food pathogens: Salmonella and Listeria, at different concentrations. The validation was performed by comparing, according to the ISO 16140:2003, the results of the complete CoSYPS Path Food workflow with the results of the conventional culture-based methods. To conclude, due to its multi-targets strategy, the CoSYPS Path Food system is reliable because a lower number of false negative results is expected compared to mono-target qPCR detection systems. Moreover, the CoSYPS Path Food system gives additional information on the detected strains (species, subspecies) thanks to its multi-levels strategy. This may facilitate the isolation and recovery of the detected strains in the sample. Furthermore, the complete CoSYPS Path Food workflow is also a fast alternative to conventional culture-based methods, as target strains are detected in two days whereas four to five days are required with the conventional ISO methods. Likewise, the complete CoSYPS Path Food workflow is as efficient as the conventional methods since the same limit of detection is obtained, i.e. 4 to 16 CFU Listeria/swab and 2 to 11 CFU Salmonella/swab, even when both pathogens are present in samples containing a high level of background microflora. Moreover, the complete CoSYPS Path Food workflow is modular as it can be adapted to different food matrices and/or target pathogens. The complete CoSYPS Path Food is therefore a good alternative to the conventional culture-based methods for the detection of foodborne pathogenic bacteria.

(fre) Les épidémies d'origine alimentaire sont une problématique importante à travers le monde. Deux agents pathogènes alimentaires parmi les plus importants sont Salmonella spp. et Listeria monocytogenes. Les méthodes de référence pour détecter ces bactéries sont des procédures internationales normalisées : méthodes ISO, qui sont reconnues dans le monde entier. Ces méthodes sont essentiellement basées sur des méthodes de culture longues (plusieurs jours) et assez laborieuses. Afin d'identifier rapidement la source des épidémies d'origine alimentaire, de mieux gérer les crises liées à l'alimentation et de permettre une libération rapide des lots autocontrôlés par les industriels du secteur alimentaire, des outils rapides et fiables pour la détection et l'identification des agents pathogènes dans les denrées alimentaires ont été développés. Les méthodes alternatives les plus prometteuses sont basées sur la PCR ou PCR en temps réel (qPCR). Cependant, plusieurs inconvénients majeurs demeurent: i) les systèmes de détection qPCR déjà développés ne ciblent, en général, qu’un agent pathogène (mono-genre) et ne permettent donc pas d’en détecter plusieurs simultanément; ii) ces systèmes de détection n’utilisent en général qu’une seule paire d’amorces (mono-cible) et ceci peut potentiellement conduire à des faux-négatifs quand la séquence cible est mutée ou délétée ; iii) ces différents systèmes de détection ne sont pas harmonisés et utilisent différentes technologies (par exemple TaqMan® ou SYBR®Green) et des programmes PCR différents. Ils ne peuvent donc pas être utilisés ensemble dans un système multi-cibles et iv) aucune directive officielle, comprenant des critères spécifiques d’acceptation, n’est disponible pour valider des analyses qPCR pour la microbiologie alimentaire. Le projet CoSYPS Path Food tend à remédier à ces inconvénients en développant et validant un système multi-genres, multi-cibles et multi-niveaux pour la détection simultanée dans les matrices alimentaires, des Salmonella spp. et des Listeria spp. vivantes. Le système développé dans ce projet s’appelle le système de détection CoSYPS Path Food pour “Combinatory SYBR®Green qPCR Screening system for pathogens detection in food samples”. Il consiste en 11 tests qPCR pour la détection des genres Salmonella et Listeria et leur discrimination au niveau du genre, de l’espèce et de la sous-espèce. Chaque niveau de discrimination (genre, espèce et sous-espèce) est constitué d'au moins deux cibles afin d’augmenter la probabilité de détecter des souches atypiques qui auraient une délétion ou une mutation dans une des cibles. Ce système multi-cibles réduit donc la probabilité de faux-négatifs par rapport aux systèmes (q)PCR mono-cibles actuels. Tous les tests qPCR développés pour le système de détection CoSYPS Path Food ont été conçus pour être exécutés simultanément sur la même plaque et ont tous été validés sur la base de deux directives existantes: une pour la validation des tests de PCR en microbiologie alimentaire (ISO 22118:2011) et l'autre pour la validation des analyses qPCR pour la détection des OGM, domaine dans lequel la qPCR est la méthode de détection de référence (lignes directrices ENGL). Pour faciliter l’analyse et l’interprétation des résultats, un outil informatique de soutien a été développé. Cet outil contient toutes les informations sur les 11 tests qPCR (séquences des amorces, concentrations de chaque amorce…) ainsi qu’un calcul automatique des mixes PCR pour chaque test et un système support de décision (SSD) afin d’obtenir une analyse uniforme des résultats. Cette interprétation automatique des résultats de la qPCR garantit d’obtenir la même conclusion quel que soit l’analyste. Ensuite, afin d’appliquer ce système sur des matrices alimentaires qui peuvent contenir des bactéries mortes ou vivantes, une étude sur la discrimination de bactéries mortes et vivantes à l'aide de la « viability-qPCR » a été effectuée. Cette étude a montré les limites de la « viability-qPCR » et a permis de conclure qu’une étape d’enrichissement avant la qPCR était préférable à l’utilisation de la « viability-qPCR ». Au regard de ces résultats, la méthode complète CoSYPS Path Food a pu être développée. Elle comprend toutes les étapes de l’enrichissement de l'échantillon alimentaire jusqu’à l'isolement et la confirmation de la souche et a ensuite été validée, sur des prélèvements externes (éponge) de carcasse de bœuf. Ce type d’échantillon a été choisi comme modèle parce que la viande est une des sources les plus importantes de toxi-infection alimentaire et l’éponge de carcasse de bœuf, qui est un échantillonnage de la surface, est reconnue comme étant la technique d’échantillonnage la plus appropriée pour le contrôle microbiologique de la viande dans les abattoirs. La méthode complète CoSYPS Path Food a donc été validée sur ces éponges de carcasse de bœuf artificiellement contaminées avec un ou deux pathogènes alimentaires : Salmonella et Listeria, à différentes concentrations. La validation a été effectuée en comparant, selon la norme ISO 16140:2003, les résultats obtenus avec la méthode complète CoSYPS Path Food et ceux obtenus avec les méthodes conventionnelles de culture. Pour conclure, grâce à sa stratégie multi-cibles, le système CoSYPS Path Food est un système fiable car un nombre inférieur de faux-négatifs est attendu par rapport aux systèmes de détection qPCR mono-cible. En outre, grâce à sa stratégie multi-niveaux, le système CoSYPS Path Food donne des informations supplémentaires sur les souches détectées (espèces, sous-espèces), qui peuvent orienter l’isolement et faciliter la récupération de la souche détectée dans l’échantillon. La méthode complète CoSYPS Path Food est aussi une alternative rapide aux méthodes conventionnelles basées sur la culture puisque les souches cibles sont détectées en deux jours alors que quatre à cinq jours sont nécessaires avec les méthodes classiques de culture. En outre, la méthode complète CoSYPS Path Food est aussi efficace que les méthodes conventionnelles puisque leurs limites de détection sont les mêmes, c'est-à-dire 4 à 16 UFC Listeria/éponge et de 2 à 11 UFC Salmonella/éponge, même si les deux pathogènes sont présents en même temps dans des échantillons contenant beaucoup de microflore annexe. Par ailleurs, la méthode complète CoSYPS Path Food est modulaire et peut être adaptée à différentes matrices alimentaires et/ou d’autres pathogènes. La méthode complète CoSYPS Path Food est donc une bonne alternative aux méthodes de culture conventionnelles de détection des bactéries pathogènes dans l’alimentation.