Treatment of triple-negative breast cancer (TNBC) through externally triggered target less drug carriers

Abstract

Cancer still ranks as a principal public health problem worldwide, being responsible for 9.9 million related-deaths in 2020. Breast cancer is the most commonly diagnosed cancer-type and the principal cause of cancer-related mortality in women, from which the triple-negative breast cancer (TNBC) subtype is the most lethal. TNBC treatment include conventional chemotherapy (e.g., doxorubicin/DOX), radiation and surgery, but response is poor, justifying the low survival rates of these patients. Thus, there is an urgent need for more specific and targeted approaches for early diagnosis, control, and treatment. The main objective of this thesis was the preclinical validation of a biocompatible theranostic probe activated in the tumor site through a specific external stimulus, a magnetic field. The nanosystem is based on magnetic solid lipid nanoparticles (mSLNs) loaded with a chemotherapeutic drug (DOX) and magnetic nanoparticles (Fe3O4), combining the synergistic effect of thermochemotherapy with non-invasive MR imaging. The combinatory effect of a dual treatment was explored in a first screening through IC50 determination in TNBC cells, where the temperature-responsive DOX-loaded mSLNs showed powerful anticancer properties against cancer cells, associated to a higher cytotoxic outcome in comparison to free DOX. Through more specific in vitro studies in 2D monolayer, mSLNs, as drug carriers, were able to inhibit cell proliferation and migration, in a time-dependent manner, being firstly internalized into the cell cytoplasm and, with an increase of incubation time, were able to release the drug into the cell nuclei. In the 3D spheroid model and the ex vivo Chick Chorioallantoic Membrane (CAM) model, the dual-treatment enhanced the penetration of the chemotherapeutic agent into the cancer cells, with improved therapeutic properties in comparison to free DOX. Then, in vivo studies were performed using an orthotopic xenograft NSG mice model. The unloaded nanoformulations demonstrated to be safe, without any detected toxic effects on animal-wellbeing and vital organ histology and promoted a T2-MRI contrast enhancement. Additionally, the DOX-loaded mSLNs demonstrated, within two weeks post-treatment, a significant capacity to inhibit tumor growth when combined with hyperthermia, in comparison to the other treatment conditions. In conclusion, the synergistic potential brought by the combination of active targeting with thermochemotherapy, provided by temperature-sensitive DOX-loaded mSLN, against TNBC cells, revealed theranostics capabilities, constituting a promising option as contrast agents for early diagnostics, coupled with an improvement in the therapeutic index in comparison to conventional chemotherapy.

O cancro é ainda o principal problema de saúde pública mundial, tendo sido responsável por 9,9 milhões de mortes em 2020. O cancro da mama é o mais diagnosticado e a principal causa de mortalidade por cancro em mulheres, sendo o cancro da mama triplo-negativo (CMTN) o subtipo mais letal. O tratamento do CMTN inclui a quimioterapia convencional (por exemplo, doxorrubicina/DOX), radiação e cirurgia, mas a má resposta à terapêutica justifica as baixas taxas de sobrevivência dos pacientes. Assim, há uma necessidade iminente de abordagens mais específicas e direcionadas para o seu diagnóstico precoce, controlo e tratamento. O principal objetivo deste trabalho é a validação pré clínica de sondas teranósticas e biocompatíveis, ativadas no local do tumor através de um estímulo externo específico, um campo magnético. O nanossistema é baseado em nanopartículas magnéticas solido-lipídicas (mSLNs) carregadas com um fármaco quimioterapêutico (DOX) e nanopartículas magnéticas (Fe3O4), combinando o efeito sinérgico da termoquimioterapia com imagem não invasiva. O efeito combinado do tratamento duplo foi explorado numa primeira triagem através da determinação do IC50, onde as mSLNs responsivas à temperatura e carregadas com DOX exibiram propriedades anticancerígenas contra células do CMTN, associado a um resultado citotóxico superior ao da DOX livre. Através de estudos in vitro usando células em monocamada, as mSLNs carregadas com fármaco foram capazes de inibir a proliferação e migração celular, de forma dependente do tempo, sendo inicialmente internalizadas no citoplasma celular e, com o aumento do tempo de incubação, confirmou se a libertação do fármaco no núcleo. Com o modelo 3D de esferóide e no modelo ex vivo da Membrana Corioalantoide do embrião de galinha (CAM), observou-se que o tratamento duplo aumentou a penetração dos agentes quimioterapêuticos nas células cancerígenas, com um aumento significativo das propriedades terapêuticas em comparação com a administração da DOX livre. Estudos in vivo foram realizados usando o modelo ortotrópico em murganhos (NSG). As nanoformulações sem fármaco demonstraram ser seguras para o bem-estar do animal, sem serem detetados, por histologia, efeitos tóxicos em órgãos vitais, com um aumento do contraste em T2-RMI. Além disso, mSLNs carregadas com DOX demonstraram, até duas semanas após tratamento, uma capacidade de inibição significativa do crescimento tumoral através da combinação termoquimioterapêutica. Em conclusão, o potencial sinérgico da combinação termoquimioterapêutica das mSLNs sensíveis à temperatura e carregadas com DOX revelou ter capacidades teranósticas, constituindo uma opção promissora para o uso como agentes de contraste em diagnóstico precoce, associado a uma melhoria do índice terapêutico em relação à quimioterapia convencional.