Sporothrix brasiliensis – from the genome to the phenotype

Abstract

Sporotrichosis is the most prevalent subcutaneous mycosis worldwide and increasing number of cases is being reported in the last decade. It is caused by thermodimorphic fungi of the Sporothrix schenckii complex and affects immunosuppressed and immunocompetent individuals. S. brasiliensis is the main causing agent of this mycosis in Brazil, where sporotrichosis is hyperendemic. This organism presents an increased virulence and a highly aggressive phenotype, with an increasing antifungal resistance. As a matter of fact, the earlier and proper diagnosis of the causing agent, in case of sporotrichosis infection, is important for its efficient treatment. Therefore, the unravelling of the virulence mechanisms of S. brasiliensis is of major importance in order to improve the diagnosis and treatment of sporotrichosis. During this work, we aimed to develop a molecular toolkit for the unravel of S. brasiliensis virulence traits. Our results from flow cytometry (FCM) for ploidy analysis of S. brasiliensis, S. schenckii, S. globosa, S. pallida and S. mexicana point to a diploid DNA content for these Sporothrix spp. Moreover, using bioinformatic tools, we performed a ploidy estimation using next-generation sequencing (NGS) data, which is in accordance with our FCM results. In the context of this work, we also developed an efficient protocol for transformation of S. brasiliensis using Agrobacterium tumefaciens. The application of this protocol resulted in 7851±3572 clones/co-cultivation, using a 3:1 ratio (A. tumefaciens:S. brasiliensis) at 27ºC for 72 h. The clones were mitotically stable, allowing the future utilization of this methodology to produce libraries of insertional mutants for identification of virulence factors. Additionally, we established an in vitro model of S. brasiliensis infection using human monocyte derived macrophages (MDMs), aiming, in the future, to analyse the transcriptome profile by dual RNA-seq of both fungi and infected macrophages. In this sense, infection conditions were optimized for more than 99% of cells internalization/adherence. This was achieved for a multiplicity of infection (MOI) of 1:3 (macrophages:fungi) for 2 h, and at least 80% of fungal cells and macrophages remained viable post-infection. These conditions were also tested for S. schenckii and similar results were obtained, allowing the comparison of the transcriptomic profile between these two organisms. This is expected to contribute for the future study of S. brasiliensis, particularly for the disclosure of its virulence traits, as well as the study of the immune response of macrophages to these fungi. This response was preliminary explored in the context of this work and MDMs presented similar fungicidal activity against S. schenckii and S. brasiliensis, and S. schenckii exhibited a more pro-inflammatory profile, with increased production of interleukin (IL)- 1Ⱦ and tumor necrosis factor (TNF)-Ƚ.

A esporotricose é a micose subcutânea mais prevalente globalmente e o número de casos reportados tem vindo a aumentar. Esta micose é causada por fungos termodimórficos do complexo Sporothrix schenckii e afeta tanto indivíduos imunocomprometidos como imunocompetentes. S. brasiliensis é o principal agente etiológico no Brasil, país hiperendémico para a esporotricose, apresentando maior virulência e um fenótipo mais agressivo, assim como uma crescente resistência a antifúngicos. Na realidade, o diagnóstico precoce e apropriado, em caso de esporotricose, é crucial para a eficiência do seu tratamento. Assim, a clarificação dos mecanismos de virulência de S. brasiliensis é de grande importância, no sentido de melhorar o diagnóstico e o tratamento desta micose. Neste trabalho, pretendemos desenvolver um conjunto de ferramentas para o estudo de S. brasiliensis. Os nossos resultados de citometria de fluxo para análise da ploidia de S. brasiliensis, S. schenckii, S. globosa, S. pallida e S. mexicana apontam para um conteúdo haplóide em ADN para estas espécies do género Sporothrix. Além disso, utilizando ferramentas da bioinformática, realizámos uma estimativa da ploidia através de dados de sequenciação de nova geração (NGS), a qual está de acordo com os nossos resultados de citometria de fluxo. Ainda no contexto deste trabalho, desenvolvemos um protocolo eficiente para transformação de S. brasiliensis usando Agrobacterium tumefaciens. A aplicação deste protocolo resultou em 7851±3572 clones/co-cultivo, usando um rácio de 3:1 (A. tumefaciensis:S. brasiliensis) a 27ºC durante 72 h. Os clones eram mitoticamente estáveis, o que irá permitir a utilização futura desta metodologia para a produção de bibliotecas de mutantes para identificação de fatores de virulência deste fungo. Adicionalmente, estabelecemos um modelo in vitro de infeção com S. brasiliensis, usando macrófagos humanos derivados de monócitos, com o objetivo final de analisar o perfil transcriptómico por dual RNA-seq do fungo e macrófagos infetados. Neste sentido, as condições de infeção foram otimizadas para mais de 99% de fungo internalizado/aderido aos macrófagos. Tal foi conseguido para uma multiplicidade de infeção de 1:3 (macrófagos:fungo) durante 2 h e pelo menos 80% das células fúngicas e dos macrófagos permaneceram viáveis após infeção. Estas condições de infeção foram também testadas para S. schenckii, tendo sido obtidos resultados similares, o que permitirá a comparação do perfil transcriptómico entre estes dois organismos, bem como o estudo da resposta imune dos macrófagos a estes fungos. Esta resposta foi preliminarmente estudada no contexto deste trabalho e macrófagos humanos apresentaram uma atividade fungicida similar para S. schenckii e S. brasiliensis. Além disso, S. schenckii exibiu um perfil mais pró-inflamatório, uma vez que levou à produção de concentrações mais altas de interleucina (IL)-1Ⱦ e fator de necrose tumoral (TNF)-Ƚ.