Macrophages in pulmonary fibrosis: characterization and fibroblasts transdifferentiation modulation

Abstract

Idiopathic pulmonary fibrosis (IPF) is the most common and lethal of interstitial lung diseases and affects around 3 million people worldwide. It is characterized by a progressive and irreversible loss of respiratory function due to lung architectural destruction. It is known that IPF comprises cycles of epithelial destruction, unbalanced formation of myofibroblasts and consequent excessive extracellular matrix deposition. Recent efforts have shifted the focus of uncovering the mechanisms of disease progression to understanding the role of inflammation, for instance pulmonary macrophages (MO) populations. In IPF, the roles of Alveolar (AMs) and Interstitial (IMs) macrophages described in literature are controversial. Thus, the main goal of this thesis was to contribute with new insights regarding whether AMs and IMs differentially modulate fibrosis progression through interactions with fibroblasts during the inflammatory phase. Bleomycin (BLM)-induced pulmonary fibrosis mouse model was used to study the proposed issues. First, MO characterization was performed by flow cytometry (FC), in the lung of untreated, BLM vehicle and BLM treated wild-type animals, at 3, 5, 7 and 9 days after its administration. We observed a progressive significant increase of IMs in treated animals. The expression of CD80, CD206 and MHCII was also assessed by FC and overall treated IMs present higher percentages of cells expressing these markers. Moreover, at day 7 after BLM administration, MO from untreated and treated mouse lungs cells were obtained by fluorescence activated cell sorting for further transcripts expression analysis of pro inflammatory and anti-inflammatory genes, by qRT-PCR. Treated IMs showed increase of several genes that can potentiate their action in promoting a pro-fibrotic micro-environment. Secondly, to answer whether AMs and IMs are differentially regulating fibrosis progression, a mouse lung fibroblasts cell line was stimulated with MO conditioned media of MO separated by fluorescence activated cell sorting at days 7 and 9 after BLM administration. After stimulation, apoptosis, proliferation, metabolic activity and transdifferentiation state were assessed. Overall, 7th day IMs conditioned media stimulate higher levels of fibroblast transdifferentiation. Taken together, the findings of this thesis indicate that, in the peak of inflammatory phase (day 7), IMs population is the one crucial for promoting lung fibrosis progression.

A Fibrose pulmonar idiopática (FPI) é a forma mais comum e letal das doenças intersticiais pulmonares, afetando cerca de 3 milhões de pessoa no mundo. FPI é caracterizada pela perda progressiva/irreversível da capacidade respiratória como consequência da destruição da estrutura pulmonar. Sabe-se que a doença envolve ciclos de dano epitelial, acumulação exacerbada de miofibroblastos e consequente deposição excessiva de matriz extracelular. Mais recentemente o foco da investigação destas doenças tem sido a compreensão do papel da inflamação na sua progressão, como por exemplo das populações de macrófagos pulmonares (MO). As funções dos macrófagos alveolares (AMs) e intersticiais (IMs) que se encontram descritas na literatura são controversas. Assim, o objetivo principal desta tese foi contribuir com novos conhecimentos sobre se os AMs e IMs modulam diferencialmente a progressão da fibrose, nomeadamente através da interação com fibroblastos, durante a fase inflamatória, utilizando para tal o modelo de ratinho de fibrose pulmonar induzido por bleomicina (BLM). Primeiramente, a caracterização de MO foi realizada por citometria de fluxo (CF), no pulmão de ratinhos normais não tratados, tratados com o veículo da BLM e tratados com BLM, aos dias 3, 5, 7 e 9 após a sua administração. Os pulmões de ratinho tratados apresentaram um aumento significativo e progressivo na quantidade de IMs. Além disto, a expressão de CD80, CD206 e MHCII também foi verificada por CF, em que foi observado um aumento da expressão dos marcadores mencionados nos IMs tratados. No dia 7 após administração de BLM, os MO de células pulmonares de ratinhos tratados com BLM e não tratados foram obtidos por separação celular com recurso a CF para posterior análise de níveis de expressão de transcritos de genes associados à resposta pró-inflamatória e anti-inflamatória, por qRT-PCR. Observou-se o aumento da expressão de vários genes pelos IMs tratados, cuja ação está na sua generalidade associada à promoção de um microambiente pró-fibrótico. Em segundo lugar, e de forma a responder se os AMs e IMs modulam diferencialmente a progressão da fibrose por interação com fibroblastos, uma linha celular de fibroblastos de pulmão de ratinho foi estimulada com meio condicionado de MO, obtidos por separação celular com recurso a citometria de fluxo, nos dias 7 e 9 após a administração de BLM. Posteriormente, foi feita a análise de apoptose, proliferação, atividade metabólica e estado de transdiferenciação dos fibroblastos. Em geral, verificamos que nos ensaios in vitro de 7 dias, os meios condicionados derivados de IMs de animais tratados apresentavam maior capacidade de transdiferenciação de fibroblastos. Em conjunto, os dados desta tese indicam que, no pico da fase inflamatória (dia 7), a população de IMs é a população crucial na promoção da progressão da fibrose.