Citogenética molecular comparativa de tartarugas marinhas da família Cheloniidae (Reptilia, Testudines) : avaliação de variações cromossômicas microestruturais

Abstract

Resumo: As tartarugas marinhas pertencem à mais antiga linhagem de répteis vivos e são componentes essenciais dos ecossistemas marinhos. São reconhecidas sete linhagens vivas de tartarugas marinhas no mundo, sendo que cinco delas ocorrem no litoral brasileiro, as quais são: Dermochelys coriacea, única representante da família Dermochelydae, e as outras quatro espécies pertencem à família Cheloniidae: Chelonia mydas, Caretta caretta, Eretmochelys imbricata e Lepidochelys olivacea. O processo de hibridização entre espécies de tartarugas marinhas na costa brasileira é atípico, sendo a maior taxa de hibridização entre as espécies no mundo, ocorrendo onde áreas de alimentação e períodos reprodutivos se sobrepõem. A citogenética de tartarugas marinhas vem se mostrando um campo promissor que permanecia até pouco tempo atrás inexplorado, permitindo que inferências evolutivas sejam feitas para o grupo a partir do estudo da microestrutura cariotípica. O estabelecimento da estrutura cariotípica para as espécies e o desenvolvimento de marcadores cromossômicos espécieespecíficos permitem o reconhecimento de cariótipos híbridos e podem ser uma ferramenta auxiliar ao reconhecimento morfológico e molecular de indivíduos híbridos. Sendo assim, esse estudo tem como objetivo ampliar o conhecimento da organização cariotípica das tartarugas marinhas da família Cheloniidae que ocorrem no litoral brasileiro a partir da obtenção e caracterização de marcadores cromossômicos para avaliar variações cromossômicas microestruturais interespecíficas e aplicar esses marcadores no estudo de dois indivíduos híbridos (híbridas A e B). Utilizou-se técnicas baseadas na coloração convencional por Giemsa, bandamentos C e G, e hibridação in situ fluorescente (FISH) com sondas de DNA ribossômico (rDNA) 5S e 18S e microssatélites (CA)n, (GA)n, (CAG)n, (GATA)n, (GAA)n, (CGC)n e (GACA)n para as espécies puras e indivíduos híbridos. Foram realizadas análises morfológicas e moleculares, utilizando genes de DNA mitocondrial (mtDNA) e nuclear (nucDNA), para identificação das espécies envolvidas nos casos de hibridismo. O uso da sonda de rDNA 5S permitiu a identificação do segundo par de macrocromossomos metacêntrico como detentor do sítio de rDNA para as quatro espécies puras e as híbridas A e B, sendo que um sítio adicional em um par de microcromossomos (mc) foi identificado para C. mydas e híbrida A. Os resultados mostram que apenas os microssatélites (CA)n, (GA)n, (CAG)n e (GATA)n são detectados nos cromossomos das espécies puras e híbridas, preferencialmente em regiões heterocromáticas dos mc. Variações na localização da heterocromatina e dos microssatélites corrobora a proposta de reposicionamento de centrômero nas espécies de Cheloniidae. A análise integrada (citogenética, morfológica e molecular) mostra que a híbrida A é um provável híbrido de segunda geração (F2) entre C. caretta x E. imbricata x C. mydas e a híbrida B pode ser resultado de um retrocruzamento entre C. caretta x L. olivacea, porém o conjunto cromossômico dos híbridos continua balanceado. Esses achados são úteis no entendimento da diversificação cariotípica das espécies e podem ser aplicados no estudo de cariótipos híbridos. Futuramente, a hibridização entre tartarugas marinhas no Brasil deve continuar a ser estudada utilizando análises integradas para compreender e determinar as consequências desse fenômeno para os indivíduos híbridos e para as espécies puras, visando estratégias de manejo e conservação.

Abstract: Sea turtles belong to the oldest lineage of living reptiles, being an essential part of marine ecosystems. Seven sea turtle living lineages are recognized in the world, five of which occur on the Brazilian coast, they are: Dermochelys coriacea, the only representative of Dermochelydae, and the other four species belong to Cheloniidae: Chelonia mydas, Caretta caretta, Eretmochelys imbricata and Lepidochelys olivacea. Hybridization process among sea turtles species on the Brazilian coast is atypical with the highest rate of hybridization among the species in the world, occurring where feeding and nesting areas overlap. The cytogenetic of sea turtles is proving to be a promising field that remained unexplored until recently, allowing evolutionary inferences to be made for the group from the study of karyotypic microstructure. The establishment of the karyotypic structure for the species and the development of speciesspecific chromosome markers allow hybrids karyotypes recognition and can be an auxiliary tool for morphological and molecular recognition of hybrids individuals. Therefore, this study aims to increase the knowledge of the Cheloniidae sea turtles karyotypic organization that occur on the Brazilian coast by obtaining and characterizing chromosomic markers to evaluate interspecific microstructural chromosomal variations and apply these markers in the study of two hybrid individuals (hybrids A and B). We used techniques such as conventional Giemsa staining, C and G-banding, and fluorescence in situ hybridization (FISH) using 5S and 18S ribosomal DNA (rDNA) and (CA)n, (GA)n, (CAG)n, (GATA)n, (GAA)n, (CGC)n and (GACA)n microsatellites probes for pure and hybrid species. Morphological and molecular analyses were made using mitochondrial (mtDNA) and nuclear (nucDNA) DNA sequences in order to identify the species involved in these cases of hybridism. The 5S rDNA site was identified in the second pair of metacentric macrochromosomes on the four pure species and hybrids A and B, in addition one extra site was identified in a microchromosome (mc) pair on C. mydas and hybrid A. The results show that only (CA)n, (GA)n, (CAG)n and (GATA)n are detected on the chromosomes of pure and hybrid species, preferentially in heterochromatic regions of mc. Variation in the heterochromatin and microsatellites localization corroborates the proposal of centromere repositioning occurrence in Cheloniidae species. The integrated analyses (morphological, molecular, and cytogenetics) shows that hybrid A is probably an F2 hybrid among C. caretta x E. imbricata x C. mydas while hybrid B could be the result of backcross among C. caretta x L. olivacea, however the chromosome sets are still balanced. These findings are useful in understanding the karyotypic diversification of the species and can be applied in hybrid karyotypes studies. In the further, sea turtles hybridization in Brazil should continue to be studied using integrated analyses to comprehend and determine the consequences of this phenomenon for hybrid individuals and for pure species, in order to develop conservation and management strategies.