Purificação e caracterização da D-Gliceraldeido-3-Fosfato desidrogenase de rim de hamster e células BHK-21 (Baby Hamster Kidney)

Abstract

Resumo: No presente trabalho D-gliceraldeído-3-fosfato desidrogenases (GPDHs) (E.C.1.2.1.12 ) de origem renal provenientes de rim de hamster e células BHK-21 foram isoladas e purificadas. A homogeneidade da GPDH de rim foi demonstrada através de eletroforese em gel de poliacrilamida em presença de SDS, a qual apresentou uma única banda correspondente à subunidade com peso molecular de 36 Kdaltons. O pH ótimo encontrado para a enzima foi de 8,2. Os valores de Km para a GPDH de rim de hamster foram determinados para o gliceraldeído-3- fosfato e para o NAD+ sendo 0,12 mM e 0,05 mM, respectivamente. ATP, ADP, AMP, AMPc, CDP, CMP, UDP e NADH demonstraram ser inibidores competitivos com relação ao NAD+- Os reagentes sulfidrílicos p-CAB, p-CMB, p-HMB, iodoacetamida e N-etilmaleimida inibiram a atividade enzimática. As inibições causadas pelo p-CAB, p-CMB e p-HMB foram parcialmente revertidas por 2-mercaptoetanol 5 mM, porém as inibições por iodoacetamida e N-etilmaleimida foram irreversíveis. A atividade da enzima de rim também sofreu interferência da ação de íons metálicos como: MgCl2, MnCl2, CaCl2, CdCl2, CuCl2 e HgCl2. A GPDH de células BHK-21 foi purificada parcialmente até a etapa da saturação com sulfato de amónio a 90%. O pH ótimo encontrado para a atividade da enzima foi de 8,4. A concentração de arseniato de sódio para a ativação da enzima foi de 30mM. Os valores de Km encontrados para a GPDH de células BHK-21 foram de 0,05 mM para o NAD+ e 0,12 mM para o substrato (G3P), em pH 8,4. As características físico-químicas da enzima de rim não diferiram significativamente das GPDHs de outras fontes citadas na literatura.