Etude de protéines kinases responsables de l'activation de la 6-phosphofructo-2-kinase cardiaque par l'insuline

Insulin stimulates heart glycolysis via 6-phosphofructo-2-kinase (PFK-2) activation thereby increasing fructose 2,6-bisphosphate concentrations. A PFK-2 kinase was partially purified, called WISK (wortmannin-sensitive and insulin-stimulated protein-kinase) and shown to be distinct from protein-kinase B (PKB). WISK has now been further purified from perfused rat hearts and from HeLa cells. Five consecutive chromatography steps were used. The relative molecular mass of WISK in the purified preparation was estimated at 63,000 by gel filtration.
The WISK preparation phosphorylated and activated recombinant bovine heart PFK-2 and was shown to contain protein kinase C? (PKC?) by immunoblot analysis. Recombinant PKC? phosphorylated and activated PFK-2 in vitro. The phosphorylation sites for WISK were S466 and T475 while the phosphorylation site for PKC? was T475 as identified by mass spectrometry. However, PKC? was not activated by insulin in perfused rat hearts. Moreover, co-transfected kinase-inactive PKC? and wild-type PFK-2 in HEK 293T cells did not prevent insulin-induced heart PFK-2 activation.
In parallel serum and glucocorticoid-stimulated protein kinase-3 (SGK3) was studied as this protein kinase has similar properties to WISK. In rat hearts treated with insulin, SGK3 was activated, as assessed by its activation loop T320 phosphorylation. Moreover, SGK3 activated PFK-2 in vitro by phosphorylating S466 and S483, the same sites phosphorylated by PKB. Co-transfection of HEK 293T cells with SGK3 siRNA indicated that this kinase was not essential for heart PFK-2 activation by insulin.
Lastly, the role of PKB was re-assessed in three different models. Firstly, co-transfection of HEK 293T cells with PKB siRNA indicated that this kinase could participate in heart PFK-2 activation by insulin. Secondly, a model of knock-in mice in which a substrate-docking site of PDK1 was specifically ablated in muscle tissues in a way that prevents activation of its substrates (SGK, p70S6K, p90 RSK) but not PKB was generated in the laboratory of Dr D. Alessi. In these mice, PFK-2 was activated in response to insulin. Thirdly, we studied heart PFK-2 activation in PKB? knock-out mice. Taken together, the results suggest that PKB participates in the activation of heart PFK-2 by insulin

La stimulation de la glycolyse cardiaque par l'insuline implique l'activation de la 6-phosphofructo-2-kinase (PFK-2), l'enzyme responsable de la synthèse du fructose 2,6-bisphosphate. Une PFK-2 kinase a été partiellement purifiée et appelée WISK (« wortmannin-sensitive and insulin-stimulated protein-kinase »). Un des objectifs de ce travail de thèse était d'améliorer le protocole de purification de WISK en vue de l'identifier. WISK a été purifiée à partir de coeurs de rat perfusés et de cellules HeLa. La masse relative de WISK estimée par filtration sur gel est de 63 000.
La préparation de WISK active la PFK-2 cardiaque recombinante et phosphoryle les résidus S466 et T475. WISK contient la protéine kinase C? (PKC). La PKC? recombinante active la PFK-2 cardiaque et phosphoryle la T475. Cependant des expériences de co-transfection de cellules HEK 293T avec un dominant-négatif de la PKC? et la PFK-2 cardiaque n'ont pas permis de mettre en évidence un rôle essentiel pour la PKC? Dans l'activation de la PFK-2 cardiaque par l'insuline. De plus, la PKC? n'est pas insulino-sensible dans des cœurs de rat perfusés.
Une étude de la « serum and glucocorticoid-stimulated protein kinase-3 » (SGK3) a été menée en parallèle. Nous avons montré que la SGK3 est activée en réponse à l'insuline dans des cœurs de rat perfusés. La SGK3 active la PFK-2 cardiaque et phosphoryle in vitro les S466 et S483. Cependant, la co-transfection de cellules HEK 293T par des siRNA de la SGK3 indique que la SGK3 ne participe pas à l'activation de la PFK-2 cardiaque par l'insuline.
Finalement, l'implication de la PKB a été réévaluée dans trois modèles différents. Premièrement, La co-transfection de cellules HEK 293T par des siRNA de la PKB indique que la PKB pourrait participer à l'activation de la PFK-2 cardiaque par l'insuline. Deuxièmement, l'activation de la PFK-2 cardiaque par l'insuline a été étudiée dans un modèle de souris présentant une mutation de la poche PIF de la PDK1 musculaire. Dans ces souris, les protéines kinases situées en aval de la PDK1 ne sont pas activables par l'insuline à l'exception de la PKB. Dans ces souris, la PFK-2 est activée en réponse à l'insuline. Troisièmement, l'activation de la PFK-2 cardiaque en réponse à l'insuline a été étudiée dans des souris déficientes en PKB?. L'ensemble des résultats obtenus dans ces trois modèles suggère que la PKB participe à l'activation de la PFK-2 cardiaque par l'insuline