Non-invasive stem cells imaging with animal PET after transplantation into the heart : experimental validation

Les cardiopathies d’origine ischémiques sont la principale cause de morbidité et de mortalité dans la plupart des pays développés. Les traitements standard actuels parviennent à réduire la sévérité des symptômes et ralentissent la progression vers l’insuffisance cardiaque mais n’ont pas d’impact sur le déficit en cellules cardiaques fonctionnelles. Depuis un peu plus d’une dizaine d’années, la thérapie cellulaire s’est imposée comme une nouvelle option possible pour améliorer le traitement de l’infarctus du myocarde et de l’insuffisance cardiaque chronique. Cependant, les multiples travaux expérimentaux et les nombreuses études cliniques realisés à ce jour ont rapporté une efficacité modérée et de nombreuses questions doivent encore être résolues afin de pouvoir optimiser cette nouvelle approche thérapeutique. Dans ce contexte, posséder une technique d’imagerie non-invasive capable de suivre in vivo le devenir de cellules souches transplantées au niveau du myocarde pourrait contribuer à répondre à certaines de ces questions. En effet, une telle technique pourrait permettre de mieux évaluer le type optimal de cellules à utiliser, la meilleure voie d’administration ou encore de nouvelles stratégies permettant d’améliorer la survie ou l’implantation des cellules. Par conséquent, le but de ce projet a été de mettre au point une technique d’imagerie non-invasive permettant de détecter, de localiser et de suivre le devenir de cellules souches transplantées dans le muscle cardiaque, tant de petits que de gros animaux. La technique développée utilise la tomographie par émission de positons (TEP) et les cellules ont été marquées au moyen du gène rapporteur de la thymidine kinase du virus de l’herpès simplex de type 1 (HSV1-tk) ou son mutant (HSV1-sr39tk). Les cellules souches mésenchymateuses (CSMs) ont été le type cellulaire initialement utilisé pour la mise au point. Le principe de l’utilisation du gène rapporteur HSV1-tk est le suivant: le gène rapporteur HSV1-tk ou son mutant est introduit dans des CSMs par transduction adénovirale ou rétrovirale. Leurs enzymes respectifs catalysent la phosphorylation de dérivés pyrimidiques et puriques ainsi que leurs analogues marqués (tels que le [F-18]-FHBG ou [F-18]-fluorohydroxymethylbutylguanine [pour l’imagerie] ou le H-3-PCV ou Penciclovir tritié [pour les expériences in vitro]). Une fois phosphorylés, ces dérivés s’accumulent à l’intérieur des cellules car les transporteurs membranaires ne savent pas les en expulser. Le signal émis par le traceur peut être enregistré et quantifié au moyen d’un détecteur approprié. Le premier objectif du travail a été de comparer l’effet de l’utilisation d’un vecteur adenoviral à l’utilisation d’un vecteur retroviral sur l’expression du HSV1- tk par les CSMs. Nous avons observé que ni la transduction adénovirale ni la transduction rétrovirale ne modifie le phénotype, la prolifération ou la capacité de différentiation des CSMs. En outre, les CSMs transduitess avec les deux types de vecteurs viraux peuvent être imagées de manière non-invasive au moyen d’une caméra TEP et de F-18-FHBG après transplantation dans un muscle périphérique de rat. Les images obtenues montrent une activité au niveau du site d’injection des cellules qui est proportionnelle au nombre de cellules transplantées. Comme attendu, l’expression du gène de la thymidine kinase par les CSMs dure nettement plus longtemps après transduction rétrovirale qu’après transduction adénovirale (2 mois versus quelques jours, respectivement). Ensuite, nous avons utilisé la technique mise au point pour imager des CSMs transplantées au niveau du myocarde de rat ainsi que pour imager des cellules souches cardiaques de souris Sca-1 positives (Sca-1+ CSCs) transplantées dans le myocarde de souris. Pour ce faire, nous avons d’abord développé une technique d’injection intramyocardique sous guidage échogaphique (à thorax fermé). Ensuite, nous avons montré que l’infection rétrovirale de Sca-1+ CSCs n’altérait ni le phénotype, ni la viabilité, ni la capacité de proliférer de ces cellules. Finalement,nous avons montré que les cellules MSCs et Sca-1+ CSCs infectées pouvaient être imagées au moyen de la TEP et de F-18-FHBG après transplantation dans le myocarde de rat ou de souris sous guidage échographique. En outre, en réussissant à imager au moyen d’une caméra PET-CT utilisée en clinique des CSMs implantées par voie trans-coronarienne dans du myocarde de cochon, nous avons montré notre capacité à pouvoir utiliser cette technique d’imagerie pour des expériences sur de « gros animaux ». Finalement, nous avons développé un algorithme original permettant de calculer la taille d’un infarctus sur des images SPECT de perfusion myocardique réalisées chez la souris, sans devoir recourir à l’utilisation d’une banque de données d'animaux normaux.

Ischemic heart disease (IHD) is a major cause of morbidity and mortality in most industrialized countries. Although therapies are available to delay disease progression,these approaches are unable to reverse or prevent the loss of cardiomyocytes that accompanies IHD. In the early 2000s, a novel regenerative therapy using stem cells (SCs) emerged as a promising alternative treatment for IHD. However, to date, results obtained from multiple preclinical and clinical studies have shown only a moderate efficacy for this treatment approach, and many questions remain. In this context, the development of a noninvasive imaging modality able to track SCs after they are delivered into the myocardium may help researchers to define the optimal cell type and delivery method, as well as to evaluate strategies for improving SC survival and/or engraftment after transplantation. Therefore, the objective of this work was to develop such a non-invasive imaging approach for the purpose of SC monitoring in small and large animals, using positron emission tomography (PET). The reporter gene herpes simplex type 1 thymidine kinase (HSV1-tk) or its mutant (HSV1-sr39tk) was introduced into mesenchymal stem cells (MSCs) by using adenoviral or retroviral vectors. The corresponding enzyme of HSV1-TK and HSV1-sr39TK phosphorylates the reporter probes, pyrimidine nucleoside derivatives and acycloguanosine derivatives (F-18-FHBG [9-(4-F-18-fluoro-3-[hydroxymethyl]butyl)guanine] for imaging and H-3-PCV [H-3-Penciclovir] for in vitro experiments). These probes become negatively charged after phosphorylation and are unable to cross the cell membrane. The intracellularly trapped radioactivity emits a signal that can be detected and quantified with an appropriate detector. A direct comparison of two types of viral vectors for transduction of the HSV1-tk gene revealed that both adenoviruses and retroviruses expressing the HSV1-tk gene could transduce rat MSCs without altering the cell phenotype, viability,proliferation rate, or differentiation capabilities. After they were delivered into a peripheral muscle of living rats, MSCs transduced with either virus were noninvasively imaged by F-18-FHBG and small-animal PET. The activity measured by PET at the injection site correlated well with the number of injected cells. As expected, retroviral transduction of MSCs allowed transplanted cells to be tracked for a longer duration than adenoviral transduction (up to 2 months vs. a few days after transduction, respectively). We tested the ability of the developed technique to image MSCs or Sca-1+ cardiac stem cells (CSCs) after their delivery into the rat or mouse myocardium, respectively. We developed a high-resolution ultrasound-guided technique to deliver SCs into the rodent myocardium. Sca-1+ CSCs were successfully transduced with a retrovirus carrying the HSV1-tk reporter gene without alteration of their phenotype, viability, or proliferation rate. Transduced MSCs and Sca-1+ CSCs were successfully imaged by F-18-FHBG and small-animal PET after their delivery into the rat and mouse myocardium, respectively, under echographic guidance. We also imaged transduced MSCs after their delivery into the pig myocardium by using a clinical PET-CT scanner. This experiment showed our ability to translate the reporter gene imaging approach from small to large animals. Lastly, we developed an original algorithm to quantify the infarct size in mice by myocardial perfusion SPECT, without the need of a normal perfusion database.