Signals and proteins involved in sorting of glycolytic enzymes to glycosomes in trypanosomatidae

Chez le trypanosome africain Trypanosoma brucei, comme chez tous les autres membres de la famille des Trypanosomatidae, la majorité des enzymes de la voie glycolytique est compartimentée dans une organelle appelée glycosome. Les glycosomes sont apparentés aux peroxysomes que l’on trouve dans la plupart des cellules eucaryotes et qui ont été particulièrement bien étudiés chez les mammifères, les plantes et chez les champignons. Les signaux qui dirigent les enzymes glycolytiques vers les glycosomes et une des protéines impliquées dans le processus d’importation ont fait l’objet des recherches présentées dans cette thèse.
La majorité des enzymes compartimentées dans les glycosomes sont importées via un signal C-terminal appelé Signal de Ciblage Peroxisomal de type 1 (PTS-1 si on utilise l’acronyme anglais). Il a déjà été montré, chez les levures et les humains, que les protéines qui portent ce signal sont reconnues par le récepteur PTS-1, également appelé PEX5. Nous avons identifié chez les T. brucei l’homologie d’un gène PEX5. La protéine encodée par ce gène possède toutes les caractéristiques d’un récepteur PTS-1. L’analyse de la séquence protéique déduite révèle sept répétitions d’un motif fortement dégénéré de 34 acides aminés qui constituent un domaine dit TPR (pour TetratricoPeptide Repeat) localisé dans la moitié C-terminale de la protéine. La moitié N-terminale de la protéine contient trois répétitions du pentapeptide W-X-X-X-F/Y qui pourraient être responsables de l’interaction avec la protéine PEX14, associée à la face externe de la membrane peroxysomiale. La protéine a été produite chez Escherichia coli et purifiée par chromatographie d’affinité pour un métal. Le récepteur est capable in vitro d’interagir fortement avec une protéine contenant un PTS-1. En utilisant des techniques biochimiques et cytochimiques, nous avons montré que, chez T. brucei, PEX5 est essentiellement présente dans le cytosol, avec une fraction minoritaire associée aux glycosomes. Cette distribution est en accord avec le modèle généralement admis pour l’importation des protéines possédant un PTS-A dans la matrice des peroxysomes.
le triosephosphate isomérase (TIM) de T. brucei est une des rares enzymes glycosomiales qui ne contienne pas de PTS reconnaissable. A fin de délimiter le signal responsable du ciblage de TIM vers es glycosomes, nous avons réalisé plusieurs protéines de fusion. Chacune de ces protéines de fusion contient un fragment de la séquence de TIM fusionné à une protéine rapporteuse, la chloramphénicol acétyl transférase (CAT) de E. coli. Des trypanosomes au stade procyclique ont été transfectés transitoirement par les plasmides encodant les différentes protéines de fusion. Après une titration à la digitonine, la quantité de protéine rapporteuse présente dans le cytosole et les organelles a été mesurée par ELISA. Nous avons identifié un peptide interne de 22 acides aminés capable de diriger la protéine rapporteuse vers les glycosomes. En accord avec son rôle possible, ce peptide est localisé à la surface de la structure de TIM de T. brucei. Plusieurs résidus du peptide ont été modifiés par mutagénèse mais ceci ne nous a pas permis d’identifier les résidus qui jouent un rôle crucial dans le ciblage de la protéine de fusion vers le glycosomes.
Nous avons montré que le PTS N-termina, ou PTS-2, présent dans la séquence de l’aldolase (ALD) de T. brucei est capable de diriger la protéine vers les peroxysomes d’un hôte hétérologue, la levure Hansenula polymorpha. Un PTS-2 est également présent dans la séquence de l’ALD du parasite apparenté Leishmania mexicana. Cette protéine a été produite chez E. coli et purifiée. Sa caractérisation biochimique a montré que les enzymes de T. brucei et de L. mexicana sont très similaires. Les structures cristallines des deux ALD ont été résolues dans le laboratoire du Prof W. Hol (Université de Washington). La résolution de ces structures révèle des perspectives étonnantes sur le fonctionnement du PTS-2.
Dans la discussion, nous proposons que le récepteur PTS-1, le signal de ciblage de TIM et le PTS-2 de l’aldolase pourraient tous trois constituer des cibles valables pour le développement de nouveaux médicaments contre la maladie du sommeil

In the African trypanosome Trypanosoma brucei, like in all members of the Trypanosomatidae family, the majority of the enzymes of the glycolytic pathways are compartmentalized in an organelle called the glycosome. Glycosomes are related to peroxisomes, found in most other eukaryotic cells, and which have been well studied in mammals, plants, and fungi. The signals that target the glycolytic enzymes to the glycosomes and one of the proteins involved in the routing process were the subject of the research described in this thesis.
The majority of the enzymes found in glycosomes are imported via a C-terminal signal called Peroxisome-Targeting Signal of type-1 (PTS-1). In yeast and human, it has previously been shown that proteins bearing this signal are recognized by a PTS-1 receptor, also called PEX5. We identified in T. brucei a PEX5 gene homologue. The protein encoded by this gene has all the characteristics of the PTS-1 receptor. Analysis if the deduced protein sequence showed seven repeats of a loosely conserved 34 amino-acid motif, constituting a so called tetracopeptide repeat (TPR) domain at the C-terminal half of the protein. The N-terminal half contains three repeats of the pentapeptide W-X-X-X-F/Y that may interact with the protein PEX14, associated with the peroxisomal membrane. The protein was produced in Escherichia coli and purified using immobilized metal affinity chromatography. The receptor was shown in vitro to strongly binf a PTS-1 containing protein. Using biochemical and cytochemical techniques PEX-5 was predominantly found in the cytosol of T. brucei with only a small amount associated with glycosomes. This distribution is consistent with the current model for the import of PTS-1 proteins into the peroxisomal matrix.
The triosephospate isomerase (TIM) of T. brucei is one of the few glycosomal enzymes that does not contain a recognizable PTS. To delineate the signal responsible for TIM targeting to glycosomes we prepared different fusion proteins between parts of the TIM polypeptide and, as a reporter protein, E. coli chloramphenicol acetyl transferase (CAT). Procyclic trypanosomes were transiently transfected with plasmids encoding the different fusion proteins. Following digitonin titration, the amount of CAT present in the cytosol or in the organelles was quantified using an ELISA system. We could identify an internal 22 amino-acid peptide able to target the reporter protein to the glycosomes. The localization of the peptide at the surface of the T. brucei TIM structure is consistent with its putative role. The mutagenesis of specific residues in the peptide did not allow us to identify the amino acids essential for the glycosomal targeting of the fusion protein.
We have shown that the N-terminal, or PTS-2, found in the T. brucei aldolase (ALD) sequence is able to direct the import of the protein into the peroxisomes of an heterologous host, the yeast Hansenula polymorpha. A PTS-2 was also found in the ALD sequence of the related parasite Leishmania Mexicana. This protein has been produced in E. coli and purified. Biochemical characterization showed that the T. brucei and L. Mexicana enzymes are very similar. The crystal structures of the two ALDs have been solved in the laboratory of Prof. W. Hol (University of Washington). The elucidation of the structure reveals surprising insight as to how the PTS-2 might function.
In the discussion we argue that the PTS-1 receptor, the targeting signal of TIM, and the PTS-2 of ALD might each constitute a good target for the development of, urgently needed, new drugs against sleeping sickness