Utilisation de Yersina comme vecteur d'expression de protéines ou d'antigènes vaccinaux à usage vétérinaire

Bacteria of the genus Yersinia are causative agents of a variety of diseases in humans and in animals ranging from gastroenteritis to plague.
Yersiniae are pathogens because of the presence of a virulence plasmid of +/-70kb called pYV. At 37°C and in media deprived in calcium, pYV+ Yersiniae restrict their growth and secrete several proteins of first importance in the virulence of the bacteria. Those proteins, called Yop, are produced in the course of infection and are very immunogenic. In vitro, they are exported without any signal peptide in the culture supernatant by an original system involving chaperone proteins.
The benign character of Y. enterocolitica infections, the marked tropism of this bacteria for the lymphoid tissue and the present knowledge of the virulence functions and their regulation have prompted G. Cornelis and coll. to convert Y. enterocolitica into a live oral carrier to deliver foreign antigens to the gut associated lymphoid tissue. The originality of the system lay on the insertion of a foreign gene downstream from a yop promoter to bring about his expression in the host, presumably when the bacteria interact with the immune system. The oral inoculation to mice of Y. enterocolitica expressing the cholera B-subunit (CT-b) under the control of a yop promoter induces an humoral immune response directed to CT-B.
In collaboration with the mucosal immunology group headed by professor J.-P. Vaerman, we have studied the immune response of mice inoculated with recombinant Y. enterocolitica expressing, without secretion, the cholera toxin B sub-unit. We showed that mice generated anti-cholera plasma IgG, intestinal sIgA and bronco-alveolar sIgA. Above all, vaccinated mice showed a protection against a lethal gut cholera toxin challenge.
Those results prompted us to construct and study recombinant Y. enterocolitica secreting eukaryotic antigens fused to the amino-terminus of a Yop protein.
We constructed several expression vectors for Yersinia, which permit the cloning of foreign gene in the three reading frames into a yop gene. By using those vectors, we produced into Y. enterocolitica fragments of the hemagglutinin if an Influenza A virus, the glycoprotein gp50 of Pseudorabies virus and the major surface antigen (P30) to Toxoplasma gondii. We showed that the produced chimeric proteins were recognized by sera from animals immunized with the infectious agents from which cloned antigen.
The sub-cutaneous inoculation (with complete Freund adjuvant) of the purified recombinant hybrid proteins led to a high humoral immune response directed against the foreign antigen. However, repeated intragastric or intraperitoneal inoculations of recombinant bacteria secreting the same hybrid proteins failed to generate a humoral or mucosal immune response against the antigens. The recombinant bacteria generated an immune response against the foreign antigens if the hybrid proteins were not secreted.
We have thus shown that the secretion system of Y. enterocolitica is a wonderfull tool for the production and the secretion of recombinant eukaryotic proteins into the culture medium. This system failed however to induce an immune response in mice inoculated with recombinant live bacteria. We have demonstrated that Y. enterocolitica could however serve as a live oral carrier to deliver non secreted antigens to the immune system

Les bactéries du genre Yersinia sont pathogènes suite à la présence d’un plasmide de virulence, appelé pYV. A 37°C et dans un milieu carencé en ions Ca2+, les Yersinia (pYV+) arrêtent leur croissance et sécrètent une série de protéines qui sont de toute première importance pour leur virulence. Ces protéines, appelées Yop, sont produites au cours de l’infection et sont fort immunogéniques. In vitro, elles sont sécrétées dans le milieu de culture par un système original impliquant des protéines chaperons spécifiques.
Le caractère bénin des infections à Y. enterocolitica, le tropisme de cette bactérie pour le tissu lymphoïde et la connaissance actuelle de ses fonctions de virulence et de leur régulation, ont permis à G. Cornelis et coll., de proposer cette bactérie comme vecteur oral vivant pour délivrer des antigènes étrangers au tissu lymphoïde associé à l’intestin. L’originalité du système repose sur l’insertion d’un gène étranger en aval d’un promoteur yop pour permettre son expression dans l’hôte, probablement au moment où Y. enterocolitica interagit avec le système immunitaire. Des expériences préliminaires d’inoculation orale de souris avec des bactéries exprimant la sous-unité B de la toxine du choléra (CT-B) sous le contrôle d’un promoteur yop, ont montré l’induction d’une réponse immunitaire humorale dirigée contre CT-B.
En collaboration avec le groupe d’immunologie mucosale du professeur J.-P. Vaerman, nous avons poursuivi la caractérisation de la réponse immunitaire de souris vaccinées par voie intragastrique avec ces Y. enterocolitica qui produisent CT-B sans la sécréter. Nous avons montré la présence d’IgG plasmatiques et IgA sécrétoires intestinales et bronco-alvéolaires dirigées contre la toxine du choléra, et surtout la protection des animaux vaccinés contre CT.
Ces résultats nous ont incités à construire et à étudier des Y. enterocolitica recombinantes sécrétant des antigènes eucaryotiques fusionnés avec l’extrémité amino-terminale de protéines Yop.
Nous avons construit plusieurs vecteurs d’expression spécifiques à Yersinia, qui permettent le clonage de gènes étrangers dans les trois cadres de lecture, en phase avec un gène yop. En utilisant ces vecteurs, nous avons produit dans Y. enterocolitica, des fragments de l’hémagglutinine d’un virus Influenza A, la glycoprotéine gp50 du virus Pseudorabies et l’antigène majeur de surface P30 de Toxoplsama gondii. Nous avons montré que les protéines chimériques produites étaient reconnues par des antisérums provenant d’animaux immunisés avec les agents infectieux dont dérivent les antigènes.
L’inoculation par voie sous-cutanée avec de l’adjuvant de Freund complet, des protéines hybrides purifiées à des souris, génère une forte réponse immunitaire humorale contre les antigènes étrangers. Cependant, les bactéries recombinantes qui sécrètent ces mêmes protéines hybrides n’induisent aucune réponse immunitaire contre ces dernières après leur inoculation par voie intragastrique ou intrapéritonéale répétée à des souris. Les bactéries recombinantes produisant ces protéines hybrides n’induisent une réponse immunitaire dirigée contre les antigènes étrangers que si les protéines chimériques ne sont pas sécrétées.
Nous avons donc montré que le système de Y. enterocolitica est un excellent outil pour la production et la sécrétion de protéines eucaryotiques recombinantes dans le milieu de culture. Ce système n’est cependant par un bon choix pour induire in vivo une réponse immunitaire contre un antigène hétérologue. Y. enterocolitica peut néanmoins servir de vecteur vaccinal vivant pour induire une réponse immunitaire contre des antigènes non sécrétés